體外培養細胞的染色體標本制備實驗

細胞

1． 體外培養的細胞，在倒置鏡下觀察到有較多的分裂細胞（傳代后24h，圓形發亮的細胞）時，加入秋水仙素溶液，終濃度為0.3μg/ml培養液；

2． 繼續培養3h；

3． 胰酶消化收集細胞至離心管；

4． 離心1000轉/min，離心10min，去上清；

5． Hanks液洗，離心，去上清；

6． 低滲處理：加入0.075mol/L KCl溶液8ml，置37℃恒溫水浴中30min，用吸管稍吹打（同上）；

7． 固定及制片如外周血染色體的制備。

1． 秋水仙素處理時間過長，分裂細胞多，染色體短小；反之，則少而細長,故秋水仙素的濃度及時間要準確掌握。

2． 固定液應在使用前臨時配制。

3． 載玻片一定要潔凈，否則染色體分散不好。

4． 染色體分裂指數低：患者處于非常時期（放、化療期）；培養基營養成分不良；培養基pH偏低或偏高；PHA過量或不足；小牛血清質量不高；培養箱溫度偏低；秋水仙素處理時間過短。

5．接種的血樣愈新鮮愈好。

6. 培養過程中，如發現血樣凝集，可將培養瓶輕輕振蕩，使凝塊散開，繼續放回37℃恒溫箱內培養。

Carnoy固定液：

固定液的重要特性是能迅速穿透細胞，將其固定并維持染色體結構的完整性，還要能夠增強染色體的嗜堿性，達到優良染色效果。單純的固定液一般難以達到這些要求，因此在實驗中使用兩種混合的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而稱其為卡諾氏固定液。Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需臨時配制，長時間放置影響固定效果，固定時間15min至24h，冰箱、室溫均可。必要時可改變甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于細胞膨脹、染色體鋪展，但易導致細胞破裂、染色體散失。

低滲液（hypotonic solution）

低滲液是指滲透壓和離子強度均低于正常細胞生理條件的溶液，滲透壓低于組織液，與外周血混在一起時，水分迅速進入細胞，使其膨脹，甚至破裂，獲得分散良好的染色體分裂象。常見的低滲液：水、低滲的檸檬酸鈉或氯化鈉、甘油磷酸鉀（0.65mol/L）、氯化鉀（0.075mol/L）等。低滲效果取決于低滲液的化學組成、低滲的溫度和處理時間。低滲處理是憑借反滲透作用使細胞膨脹染色體鋪展，同時可使黏附于染色體的核仁物質散開，以便能在一個平面上觀察所有染色體形態。實驗室中一般選用0.075mol/L KCl為低滲液，其優點有：①染色體輪廓清楚，可染色性強，染色時間短。②用于顯帶染色時能充分顯示帶型特點。低滲處理為37℃，25～30min，以預實驗條件為準。

Giemsa染液

Giemsa原液配制：稱Giemsa粉末0.5g，加幾滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油總量為33ml）。56℃中保溫90～120min。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存。使用時按要求用PBS稀釋，一般稀釋10倍。