載體與外源DNA分子體外重組時，如何選擇優化連接條件以達到最高的重組率。因此有必要根據影響連接效率的因素綜合考慮連接條件。影響連接效率的因素很多，如反應溫度、插入片段和載體之間的摩爾比、DNA末端性質、反應時間、ATP濃度等。
1.
反應溫度是比較重要的影響因素。因為連接酶的最適反應溫度為37℃，但在此溫度下僅含4-6bp的退火粘末端之間的氫鍵結合不穩定（Tm≤15℃），不足以抵抗拒熱運動的破壞，因此連接溫度應介于酶的最適溫度和粘末端退火溫度之間，一般為4-22℃，平末端連接溫度要更低些。退火粘末端之間的連接可視為分子內的連接，而平末端之間為分子間的連接。
從分子動力學角度講，后者更為復雜，且速度也要慢得多，因此平末端的連接效率要低一些為粘末端連接效率的1/10-1/100。一般采用如下組合：粘端連接反應16℃12小時或22℃4-5小時，平端連接反應4-8℃12小時。
2. 插入片段和載體之間的摩爾比經驗值一般為3-10， 即插入片段要多于載體數，這樣有利于提高重組率。一般的計算公式為：
3. 連接酶用量一般為0.1-2U,平端連接酶用量要高一些。
4.ATP濃度一般為10μΜ-1mM ,但載體環化受ATP濃度影響較大，當ATP濃度為0.1mM 環化程度最大。
5.如在反應緩沖液加一定濃度PEG可以提高連接效率。
一、材料，試劑和儀器
1 材料:質粒載體，插入DNA片段
2 試劑: Promega 公司的T4DNA連接酶試劑盒
3儀器：恒溫水浴鍋
二、實驗程序
1 連接
1) 采用20ul的體系，在滅菌的200μlEppendorf管中順序加入：
2） 14-16℃連接反應過夜。
三、結果與分析
連接成功與否，有的實驗指導書上建議連接后采用電泳檢測，除載體和目的DNA片段外，還應出現一條或幾條電泳相對滯后的重組DNA帶，表明重組成功。這在載體和目的DNA片段充足的條件下檢測不失為一種直觀的方法。但如果載體和目的DNA片段量較少，這種檢測就不經濟了，倒不如做載體和插入片段不同比例的連接體系能獲得好結果。