體細胞突變對胚胎發育的分化過程進行新的探究和定義

　　胚胎發育過程中人體造血系統發育在以前主要是通過顯微鏡觀察來確定的。

　　近日，來自英國韋爾科姆基金會桑格學院研究所的Ana Cvejic研究組與Peter J. Campbell研究組合作在Nature雜志上發表題為Lineage tracing of human development through somatic mutations的文章，利用體細胞突變對人類造血系統的發育過程進行譜系追蹤，對胚胎發育的分化過程的不同階段進行了新的探究和定義。

　　人類胚胎發育始于受精卵分裂為卵裂球，然后形成內細胞團和滋養層。內細胞團進一步分化為上胚層（Epiblast）和下胚層（Hypoblast）。下胚層被認為主要產生胚外組織，而上胚層形成三個胚層：產生表皮和神經系統外胚層（Ectoderm），產生心臟、腎臟、肌肉和結締組織的中胚層（Mesoderm）以及產生肺部和消化道的組成部分的內胚層（Endoderm）。造血系統細胞在出現妊娠后第16天，人類胎兒組織學研究表明，在懷孕第8周(Post-conception week，pcw)時90%的紅系細胞來源于原條（Primitive streak）。胎兒中造血干細胞和祖細胞突變的積累可以用于深入了解人類胚胎以及胎兒時期發育的動態過程和造血系統功能的起源。作者們對來自人類胚胎的造血干細胞和祖細胞的單細胞衍生細胞群落進行全基因組測序，并對已知來源的組織進行深度靶向測序，從而建立起胎兒發育的系統發育樹。

　　圖1 造血干細胞與祖細胞系統發育樹以及實驗工作流程

　　作者們首先從懷孕后第8周以及第18周的兩個正常男性胎兒中采集造血器官，并使用熒光活化細胞分選的方式分離出單個造血干細胞與祖細胞（圖1）。作者們在體外擴增了單個造血干細胞與祖細胞，并通過全基因組測序將其測序深度增加至約15倍。在8周胎兒中作者們對單個造血干細胞與祖細胞來源的277個細胞克隆進行了測序。在18周胎兒中肝臟和骨髓都會支持血液的產生，因此作者們對兩種來源的234個細胞克隆進行了測序。然后對這些深度測序的克隆進行系統進化樹的構建。

　　隨后作者們對該測序結果的敏感性以及特異性通過模擬進行評估。在對敏感性進行調整后，作者們對樣品中的突變負擔進行測量，發現在8周胎兒以及18周胎兒中，每個造血干細胞與祖細胞的單核苷酸變異量分別為25.5個突變以及41.9個突變。另外，作者們對構建的系統進化樹進行了不對稱性的分析，發現與先前的研究相一致的是，最近的共同祖先的兩個子細胞貢獻的不對稱性具有相當大的差異，該結果表明此種不對稱性并非是程序性調控的。

　　進一步的，作者們對發育過程突變獲得時間點與發育事件的時間點相匹配（圖2），與造血干細胞與祖細胞共享最少突變的組織可能是最先從產生造血細胞的祖先系中分離出來的，而更多的共享意味著后來逐漸進行的分化過程。用此方式，作者們對所有的胚胎以及胚胎外的組織的發育計時進行了組織，可以對發育過程中不同事件發生的時間點進行總結。在小鼠中，滋養層和內細胞團之間的分子分歧發生在8-16細胞階段，但在人類中這一事件的發生并不確切清楚。作者們發現在8周胎兒體內此分歧事件發生在4-16細胞期，這與小鼠的發育過程類似。胚胎發育過程的另外一個重要事件是上胚層分化。作者們發現在上胚層分化時，至少有20種血液前系血統已經存在，這與最近對人類早期發育的體外觀察結果一致。因此，該系統進化樹的構建對于人類胚胎發育過程中關鍵事件的計時提供了確切的證據。

　　圖2 發育過程中胚胎內與胚胎外的分化時間

　　作者們的數據表明，與內胚層和中胚層相比，外胚層的來源造血系統的祖先只有較少的貢獻。而且8周胎兒在循環系統中捕獲的原始血液來自下胚層，其體細胞突變與胚胎外、中胚層組織的體細胞突變有更高的相關性。

　　總的來說，該研究為未來通過使用自然發生的體細胞突變作為條形碼對人類發育過程進行理解提供了一個可能的工作流程以及概念框架。