結果與討論
肽分離
MassPREP肽混合物含有9種不同的肽，氨基酸組成、質量、長度和極性各有不同。肽序列如表1所示。由于該混合物由這樣一組多樣的肽組成，所以對于評價質譜性能和色譜性能是很有用的。鑒于此，相對于其他常用于肽分析的固定相，肽混合物被用作檢測CSH130 C18的分離性能。本研究還包括用于高效分離混合物中大孔徑肽(100 ? ~ 300 ?)的固定相，這些肽的分子量均低于 3kDa。另一個單獨的應用紀要對使用130 ?孔徑的CSH130 C18分離更大的多肽進行了討論。11為了研究相關性，使混合物中每種肽的上樣量與抗體肽圖所用的常用條件接近，其中20 ~ 50 μg的Lys-C消化液或胰蛋白酶消化液一般在內徑為2.0 mm或2.1 mm的色譜柱上進行分析。2,12-13同樣，分離使用含有強離子對試劑TFA、較弱的離子對試劑FA或兩者結合的流動相完成。肽反相分離通常與質譜聯用，在各種條件下得到的性能頗引人注意。在這些應用中，因為甲酸能夠提供靈敏度更高的檢測，所以選用甲酸而非三氟乙酸作為流動相添加劑。14-15
圖1是在不同的流動相條件下使用一根5 μm硅膠C18色譜柱得到的三張MassPREP的色譜圖。使用TFA進行分離得到的色譜峰一般都是對稱的。大部分色譜峰并未出現過度的峰展寬或拖尾的現象。但是，使用含有甲酸的流動相得到的峰形極不理想。此外，混合物中最大的肽——蜂毒素并未被檢測出來，原因可能是峰過寬或根本沒洗脫出來。對于使用HPLC進行的肽分離，這樣的結果是很常見的。
使用亞2 μm顆粒可讓肽分離的性能更加優越。在兩種均以1.7 μm顆粒填充的色譜柱上得到的色譜圖見圖2和圖3。特別是圖2中的色譜圖，它們使用表面多孔型C18色譜柱得到。在流動相中加入TFA時，得到的色譜峰是對稱的，并且一般比使用5 μm多孔型C18色譜柱得到的色譜峰更窄，如圖1所示。在流動相中加入極少量TFA或者不加TFA時，色譜峰變寬并出現明顯拖尾。在所有測試條件下，全多孔BEH130 C18色譜柱分離的效果與表面多孔型C18色譜柱相當，如圖3所示。
圖1至圖3表示的分離用于檢測CSH130 C18,1.7 μm色譜柱肽分析的性能。對應的色譜圖如圖4所示。圖1至圖4的對比清楚表明，無論是使用含有TFA還是FA的流動相，與其他色譜柱不同的是，CSH130 C18都能夠提供最佳的峰形。此外，可以明顯看到，CSH130 C18 表現出獨一無二的選擇性——尤其使用不含TFA的流動相情況下。例如，在流動相中僅加入0.1%的甲酸，在本研究所用的其他任何色譜柱上(CSH130 C18除外)，肽8和肽9均未得到很好的分離。而使用CSH130 C18時，這兩種洗脫是峰形對稱并在3分鐘以上的時間內分實現分離。另外，這些色譜柱之間也存在保留能力的差異。最值得注意的是，CSH130 C18色譜柱的保留能力稍弱于本研究涵蓋的其他色譜柱。這正好印證了CSH130 C18是唯一一種表面帶有少量正電荷吸附劑的事實。帶正電荷的肽與CSH130 C18表面之間的庫侖斥力很可能是CSH130 C18保留能力較低的原因。圖4的插圖顯示了在CSH130 C18色譜柱上使用0.1%FA梯度時的最早洗脫部分。在這些條件下，親水性最強的肽RASG-1(肽1)在孔隙體積標記附近出峰。與BEH130 C18色譜柱相比，一般使用CSH130 C18洗脫肽時所使用的ACN的量要少2% ~ 4%。 使用0.1%TFA時，保留能力的差異最小，而使用0.1%FA時，保留能力差異最大。分析極性很大的肽時，CSH130 C18的初始梯度條件可能需要作相應的調整。
峰容量和質譜信號
對這些定性分離的比較表明CSH130 C18比其他色譜柱具有性能上的優勢。但是，定量更引人注目。在每個分離中觀察到的峰容量按照實驗部分的方法計算。圖5A顯示了在每種色譜柱上酸性改進劑組成與峰容量之間的關系。圖5A的左部分是僅使用FA而不使用TFA離子對試劑得到的峰容量值。沿X軸向右是與FA濃度降低、TFA濃度升高時對應的峰容量值。CSH130
C18色譜柱的性能優勢很容易顯現出來。使用0.1%TFA時，CSH130 C18色譜柱的峰容量比其他1.7 μm C18色譜柱大20%。但是，如果使用含有0.1%甲酸的流動相，CSH130 C18色譜柱的峰容量比其他1.7 μm色譜柱大90%。因此，CSH130 C18不僅比其他色譜柱具有更大的峰容量，而且其性能對三氟乙酸的依賴性很小。由此帶來的最明顯效果是CSH130 C18色譜柱與質譜具有很高的兼容性。在這些分析中，三氟乙酸對肽質譜檢測的影響見圖5B。我們知道，在電噴霧離子化過程中，TFA會引起嚴重的離子抑制16-17。因此，使用TFA而不使用FA時，質譜信號降低12倍。CSH130 C18色譜柱并不需要太多TFA(如果有)來獲得最佳峰容量，因此成為需要高靈敏度LC/MS應用的理想選擇。