為了分離短桿菌肽物質，對酸性改性劑的影響進行了研究，結果表明：使用三氟乙酸(TFA)可得到稍好的峰形，提高了短桿菌肽A和短桿菌肽C之間的分離度，結果如圖2所示。已知TFA會抑制質譜電離，但每種物質的信號都足以定量檢測治療制劑，后續將對此進行討論。對于要求更高靈敏度的應用，可能需要降低TFA濃度或使用甲酸，以達到希望的檢測限值。
圖2.酸性改性劑對分離短桿菌肽的影響。
當設置好合適色譜條件后，通過減少梯度時間優化分離過程，結果如圖3所示，我們能夠在1.5分鐘時間內使每種短桿菌肽組分的分離度達到1.4或更高，在相同流速下通過減少運行時間增加梯度斜率，不但實現有效分離，同時還將短桿菌肽A的信噪比從336提高至605。
圖3.UV 280-nm痕量檢測優化分離短桿菌肽A、B和C。
我們測試了最佳分離條件，能夠使用單四極桿質譜(SQD)檢測每種物質，圖4顯示：每種物質都被質譜良好分離和檢測到，另外每種短桿菌肽物質都顯示含有絕大多數的M+2H離子，后續的研究將使用這些參數進行選擇離子監測。
圖4：每種短桿菌肽物質的總離子圖譜-A和加合離子圖譜-B-D。選擇強度最高的離子評估市場上銷售的抗菌制劑中的短桿菌肽含量，對于多肽序列，紅色殘基是L型同分異構體，黑色殘基是D型同分異構體。
為了評估我們的方法是否適用于定量分析市場上銷售的非處方藥中的短桿菌肽，我們在ACQUITY SQD上使用選擇離子監測，結果如圖5A所示。我們繪制濃度-峰面積曲線，得到每種物質的校正曲線。結果發現：如圖5B-D所示，每種成分在測試范圍內都呈線性響應。另外還使用校正曲線測定了非處方藥物中的每種短桿菌肽物質濃度。
圖5，圖A-25.0、12.5、1.25和0.625mg/mL濃度的標準溶液中含有短桿菌肽物質的疊加選擇離子譜。圖B、C和D-每種短桿菌肽A、B和C各自的MS峰面積線性擬合圖。
使用開發的方法評估非處方藥物中的短桿菌肽物質的濃度和相對豐度。如圖6所示，重復分析結果表明：每種短桿菌肽%RSD值小，計算濃度與標簽上的標稱值相吻合；我們還發現短桿菌肽物質的相對豐度與文獻報道的豐度非常吻合1。
圖6. 從抗菌軟膏中萃取的短桿菌肽A、B和C的疊加選擇離子譜重復進樣分析的計算RSD值(N=3)在可接受限值以內，計算豐度與文獻報道數值非常吻合1。
結論
正如本應用紀要所展示的，ACQUITY UPC2系統與ACQUITYUPC2色譜柱化學結合使用，可為短桿菌肽提供簡單、準確和可重現的分析方法。該工作表明ACQUITY UPC2系統可用于分析疏水性肽，還可能用于分析疏水性蛋白質，例如膜蛋白。
參考文獻
1. The Merck Index and Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals.13th ed. Whitehouse Station, NJ : Merck Research Laboratories; 2001.