使用Viscotek TDAmax多檢測器凝膠滲透色譜檢測分離乳清蛋白（WPI）
概述
乳清（Whey）是在奶酪生產過程中，牛奶凝結成凝乳塊后分離出的呈綠色的、半透明的液體，是生產過程中的一個副產品。分離乳清蛋白（Whey Protein Isolate，簡稱WPI）是從中提取的一種膳食補充劑。分離乳清蛋白可以做到純度很高，幾乎無糖，無脂肪。分離乳清蛋白在整個牛奶中的含量僅為0.7%左右，彌足珍貴。
分離乳清蛋白具有很高的營養價值，已成為各種保健食品中的重要功能成分。WPI廣泛用于嬰兒配方,是嬰兒生長發育過程中最佳的天然氨基酸來源，也廣泛作為乳化劑和穩定劑應用在食品工業。WPI由于其能迅速被吸收消化，幫助改善運動后身體的代謝狀態，也深受運動員和健身愛好者喜愛。它已被報道，WPI可能過程抗炎和抗癌特性。
WPI由四個主要部分組成：β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin）、血清白蛋白（serum albumin）和免疫球蛋白（Immunoglobulins）。
β-乳球蛋白是WPI的主要成分，存在于許多其他哺乳動物物種的乳汁中。然而，不存在于人類母乳。約85%對牛奶過敏的兒童在他們三歲后不再過敏，但仍有15%過敏。β-乳球蛋白是牛奶中的主要過敏原，所以乳制品生產商需要標注β-乳球蛋白存在與否，以確保滿足不同消費者的需要。β-乳球蛋白是由162個氨基酸組成的蛋白，分子量為18.4kDa，在生理條件下以二聚體形式存在。
α-乳白蛋白存在于幾乎所有的哺乳動物物種的乳汁中，參與到乳糖的合成代謝，分子量為14178 kDa。
血清白蛋白是由肝臟產生的，其功能主要是作為血液中的一種載體蛋白，運輸類固醇，脂肪酸和甲狀腺激素，它在通過貢獻膠體滲透壓來穩定細胞外液容量中，起著重要的作用。血清白蛋是水溶性的球狀蛋白，分子量約為65kDa。
免疫球蛋白（Ig），也被稱為抗體，免疫系統通過其識別和中和外來物，如細菌和病毒。在胎盤類哺乳動物中有五種抗體同種型，分別稱為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。免疫球蛋白分子量約為150kDa。
材料與方法
使用馬爾文公司的Viscotek TDAmax多檢測器凝膠滲透色譜系統進行分析測試：示差折光檢測器（RI）、紫外檢測器（UV）、7°角光散射（LALS）、90°角光散射（RALS）和粘度（IV）探測器。
● 色譜柱為Viscotek p-columns系列，1 * P4000和1 * P3000。
● 流動相為0.1M pH7.0的磷酸鹽緩沖液，進樣量約為500μg。
● 使用Omnisec軟件進行數據分析處理。
結果與討論
1) 組分解析
X軸為保留體積，Y軸分別為示差RI檢測器、紫外UV檢測器、直角光散射RALS檢測器、小角光散射LALS檢測器和粘度DP檢測器。
免疫球蛋白 | 血清白蛋白 | β-乳球蛋白 | α-乳白蛋白 | |
峰值保留體積-(ml) | 17.057 | 18.174 | 19.238 | 20.349 |
數均分子量（Da） | 150,329 | 70,310 | 30,745 | 15,410 |
重均分子量（Da） | 151,366 | 70,469 | 31,847 | 15,549 |
Z均分子量（Da） | 152,485 | 70,635 | 33,125 | 15,697 |
峰值分子量（Da） | 127,955 | 69,619 | 30,683 | 15,800 |
多分散度Mw / Mn | 1.007 | 1.002 | 1.036 | 1.009 |
特性粘度（dL/g） | 0.0596 | 0.0506 | 0.0339 | 0.0289 |
流體力學半徑（nm） | 5.181 | 3.833 | 2.564 | 1.921 |
組分含量（%） | 0.024 | 0.064 | 0.737 | 0.175 |
所有樣品的dn/dc均設為0.185。
峰3的組分顯示分子量為33kDa左右，在組分中的質量百分含量為75%左右，這個組分應為β-乳球蛋白，其在活性狀態為二聚體，且是WPI中的主要組分。
峰4的組分為α-乳白蛋白，分子量15kDa，與理論值相符。一個有趣的發現是，α-乳白蛋白示差峰的響應不到β-乳球蛋白的一半，α-乳白蛋白的紫外信號響應很接近β-乳球蛋白，這表明α-乳白蛋白在280nm處比β-乳球蛋白具有更高的紫外消光系數。
峰1和峰2的分子量分別為150K和70K，根據分子量得知峰1為免疫球蛋白，峰2為血清白蛋白。
所有四個峰的多分散性PD值都小于1.04，這是預期相符，事實上，所有蛋白質都是單分布的。
凝膠色譜的分離機制是體積大的組分先流出，體積小的后流出，流體力學半徑Rh與分子量的結果，確認較低的分子量蛋白質有較小的尺寸。特性粘度也隨著分子量的減小而降低，但不是線性關系，表明不同蛋白結構間的差異。β-乳球蛋白最好的解釋了這種現象，β-乳球蛋白的分子量是α-乳白蛋白的兩倍左右，特性粘度只高出15%左右，這說明二聚體的β-乳球蛋白比單聚體的α-乳白蛋白結構更加緊湊。
2) 聚集體檢測
在10-12ml低保留體積，RALS與LALS都出峰，而RI或UV未出峰，RI和UV信號正比于濃度，所以組分濃度很低；LS是分子量與濃度乘以分子量成正比，所以分子量只有很大才能生成光散射峰。另一個聚集峰的特征是，低保留體積，說明其尺寸大。粘度檢測器也未出峰，說明聚集體非常緊湊，因此特性粘度低。
結論
本應用報告的數據表明，馬爾文Viscotek TDAmax多檢測器凝膠滲透色譜系統可用來分離復雜的蛋白質混合物，如WPI。在本篇報告里，通過一個測試得到WPI的四個組成部分：β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白的分子量、組分含量、流體力學半徑以及結構相關的信息。并且，通過光散射檢測到了濃度低、不易被RI示差檢測到的聚集體。Viscotek TDAmax的此類應用使其成為食品與營養應用研究、以及生物制藥領域中蛋白研究的的理想方法。