假單胞菌轉錄調節因子AlgR通過非編碼RNARsmZ調控脂肪酶LipA表達探討

參考文獻：The Pseudomonas transcriptional regulator AlgR controls LipA expression via the noncoding RNA RsmZ in Pseudomonas protegens Pf-5. Biochemical and Biophysical Research Communications（IF2.466）
關鍵技術：EMSA、基因敲除CRISPR-Cas9、lacZ報告基因假單胞菌轉錄調節因子AlgR通過非編碼RNA RsmZ調控脂肪酶LipA表達機制探討　　脂肪酶（Lipase）是一種存在于動物、植物、微生物中的工業用酶，廣泛應用于食品、去垢劑、生物質能等領域。目前商品化的脂肪酶主要來源于微生物，但傳統的育種、培養基營養優化的手段在提高其產量方面面臨瓶頸，亟待從分子機制層面尋找解決途徑。　　目前研究證實細菌中脂肪酶的表達受到雙組份調控體系如LipQ-LipR調節，但假單胞菌P. protegens Pf-5菌株的分子調控機制有待深入研究，AlgR作為轉錄調控因子在假單胞菌P. protegens Pf-5菌株中對于脂肪酶產量控制關系及機理此前還未見報道，同時已知AlgR也能夠調節ncRNA RsmZ，故而本文采取基因敲除、lacZ報告基因、EMSA等方法研究AlgR對于lipA的表達調控機制。
研究內容及結果1. 證實AlgR在轉錄水平控制lipA表達　　構建了algR敲除的Pf-5菌株（名為Pf6003），培養測定其生長曲線，并檢測對比敲除菌株中lipA酶活性。結果顯示野生型、algR敲除型Pf-5菌株的呈現一致生長曲線，說明algR的敲除不影響Pf-5的生長（圖A），但是敲除株的總脂肪酶活性顯著下降（圖B）。 　　此外將lipA的啟動子連接lacZ報告基因、將報告基因質粒分別轉入野生型及突變型Pf-5菌株，后續檢測β半乳糖苷酶（b-galactosidase）活性，發現在敲除突變株中b半乳糖苷酶活性低于野生型（圖C）。通過RT-PCR檢測lipA的mRNA表達，顯示突變株中lipA mRNA水平降低（圖D）。 
　　同時通過lacZ報告基因實驗顯示algR的補償過表達在野生型和缺失突變型Pf-5中都能提高β半乳糖苷酶活性及lipA酶活性。　 
2. AlgR影響rsmX/rsmY/rsmZ的表達　　使用RT-PCR實驗證實在Pf-5菌株中敲除AlgR基因后，rsmX/rsmY/rsmZ的轉錄水平均上調。 
3. AlgR直接結合于rsmZ啟動子序列　　本文表達純化了AlgR蛋白、合成了rsmX/rsmY/rsmZ啟動子序列的探針，進行EMSA實驗驗證AlgR蛋白同這些基因啟動子序列的互作關系，證實AlgR蛋白存在直接相互作用、而AlgR蛋白不能結合于rsmX/rsmY的啟動子序列。 
5. AlgR通過rsmZ調節lipA的表達　　構建了rsmZ敲除的Pf-5菌株（名為Pf6285），并構建了同時雙敲除algR和rsmZ的Pf-5菌株（名為Pf6100），通過lazZ報告基因及酶活力測定顯示，同時敲除algR和rsmZ基因的Pf6100中lipA表達及總酶活性顯著低于algR單獨敲除的菌株，而在algR單獨敲除株中過表達rsmZ能夠使lipA酶表達及活性恢復到野生型水平。 總結　　構建了分別單獨敲除algR或rsmZ的假單胞菌株Pf-5，及同時敲除algR和rsmZ的菌株，通過lacZ報告基因系統以及細胞總酶活力測定，證實了algR的缺失突變導致lipA水平下降，同時rsmZ的過表達能夠補償algR缺失對于lipA的下調效應，并通過EMSA實驗驗證了AlgR蛋白能直接結合于rsmZ的啟動子序列，說明algR基因是通過rsmZ來調控假單胞菌株Pf-5中lipA的表達水平。
　　本文采取基因敲除Cas9、lacZ報告基因、EMSA等方法研究AlgR對于lipA的表達調控機制，在表觀遺傳調控、非編碼RNA、蛋白互作等的應用極其成熟，可@qq3268908524索取文獻全文及服務溝通......