做原核表達的幾點教訓和體會

最近在做原核表達，包涵體。以前也做過，但經驗不多。一點失敗的教訓以及純化過程中的體會，貼出來與大家共享，同時希望得到同行們的指正
1. 首先介紹一下背景。載體是invitrogen公司的pET22b，Amp抗性。菌株是該公司的BL21 star DE3，是一個蛋白降解酶突變菌株，也就是說是一種優化表達菌株。
2. 第一次失敗。第一次做誘導的時候，重復了很多次，但總是誘導不出來。PCR，酶切都正確。但沒等測序結果出來就開始做了。失敗了。曾在園子求助。后來證明是引物錯誤。我們實驗室合成引物都要先發給purchasing office，然后才由他們與公司交涉。這個office的老太太把引物弄掉了一個堿基。
教訓：在實驗過程中，再仔細都是不為過的。引物來了后管壁上貼有序列，但我忽略了。
3. 第二次失敗。后來重新構建，轉化，誘導。第一次誘導時根本就沒帶。見附圖（圖片質量太差了，sorry，下面幾個帖會逐漸好轉。我們都在失敗中提高，進步，不是嗎）
然后開始找悶頭原因。周一下午5點我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看醫生了，等了很久，到第二天中午11點才轉接！而且是按1:50轉接的！也就是菌在轉接之前培養了18 h！
我們都知道，帶Amp的E.coli在含Amp的平板上培養超過16 h后，菌周圍會長出小菌落，我們叫它衛星菌落。這是因為細菌在生長的時候，為了抵抗Amp，會分泌B－內酰胺酶，而該酶會降解培養基中的Amp。對Amp產生抗性的機制和其他抗生素的情況是不同的（具體可以翻看分子克隆）。到菌體生長到足夠濃度的時候，培養基的Amp就會慢慢減少。一旦細菌失去選擇壓力，就可能造成質粒丟失。當Amp降到很低，不足以抑制細菌生長時，未攜帶質粒的菌就會長得比帶質粒的快。所以當培養時間足夠長后，培養基中的B－內酰胺酶就會積累到很高的濃度。轉接時（我是1:50轉的），高濃度的酶可能破壞新鮮培養基中的Amp（而且我用的濃度是50 ug/ml）。這樣，就造成最后收集的菌中，大部分都是沒有帶質粒的菌了。
當然還有一個可能的原因就是死亡的菌體分泌一些降解酶，使得表達檢測失敗。
這兩種推測都只是推測，但我覺得第一種情況應該引起我們的重視。在使用Amp抗性的時候要格外注意。

4. 第三次做誘導就格外小心了。首先，晚上12點我才接菌，到第二天早上就開始轉接了。這次用的是100 ug/ul的Amp濃度。轉接的時候是1:500稀釋。（我不知道1:100行不行，一朝被蛇咬，十年怕井繩啊。在OD600達到0.8的時候誘導。
轉接的時候做對照：IPTG 0 h，
同時做誘導：2 h, 3 h
結果見附圖。圖注的大概意思：
從左到右的泳道依次是：陰性對照，誘導2 h，誘導3 h；由于我做的是包涵體，所以前面點的都是沉淀，16，17點的上清。但這兩個泳道太難看了。后面的膠會好一點，sorry
主要結果有三：
A. 有表達，
B.陰性對照也有表達，所以這個結果不是很convincing
C. 目的蛋白應該在30 kD，但分子量顯示是36 kD左右（這個問題是個低級錯誤，接下來的帖子會指出）。
原因分析：
為什么陰性對照會有帶？我想起表達毒性蛋白的protocol. 表達毒性蛋白的時候，由于DE3可能根本就不長，或者長得很慢，這時候我們會在培養基中加glucose。當培養基中有其他首選碳源，如glucose時，細菌會優先選擇glucose，而glucose會抑制cAMP的活性從而關閉乳糖操縱子。
為什么要加入glucose呢？我們用的DYT或者LB培養基中含有豐富的tryptone。后者可能含有微量的乳糖。所以雖然沒有加IPTG，其中的lactose同樣可能誘導蛋白的表達。這樣毒性蛋白在加IPTG前就開始表達了，殺死或者抑制了細菌的生長。
那么我的這個實驗中，陰性對照出現的帶是不是也是因為這個原因引起的呢？
要驗證陰性對照中的帶是不是由于培養基中的微量lactose的，可以做如下實驗，
A. 測培養基中乳糖含量；
B. 購買無乳糖培養基；
但是我不愿浪費時間在這上面。。。賣個關子哈
實際上，我做了如下的一組處理：
a. 陰性對照＋2％glucose
b. 陰性對照 without glucose
c. 誘導2 h
d. 誘導3 h
這個處理其實存在設計上的錯誤。如果要得出嚴謹的結論，應該要加一個2％glucose的誘導處理。這樣，預期的結果就是：
a, 無目的條帶，
b, 有目的條帶，但不夠多，
c, 有
d, 有
e, 2％glucose, 誘導，無目的條帶或者僅有很淺的帶。
很抱歉，e沒有做。那天很久沒用的兩瓶glucose中的一瓶被污染了。。。

結果見附圖。
圖注的大概意思：
從左到右的泳道都是按a, b, c, d處理排列的。5－8以及13－16泳道是positive expression control。是pET15b攜帶b-galactosidase的一個構建。泳道1－8是全細胞蛋白電泳；泳道9－12是取沉淀電泳；13－16是上清電泳。結果：
a. 有glucose的陰性對照無帶（或非常淺）
b. 無glucose的陰性對照有帶，但整體來說比誘導的弱
c. 誘導的有帶
d. 蛋白大小還是不對（其實是對的，我冤枉它了，請看后面的帖子）。
結論：培養基中確實很可能存在lactose。而且應該是造成陰性對照有表達的原因。

現在頭疼的就是分子量的問題了。
首先，切膠做MS。見附圖。那三個洞洞就是偶挖滴

根據公司的報告，這個蛋白就是我們要的蛋白。
然后就開始懷疑分子量marker了。
細心的戰友可能發現了，我下面這個圖marker其實跟上面幾個圖都是一樣的，但標的不一樣了。這就是我說的低級錯誤：
我之前的圖是按Tris-HCl buffer，12％的膠標的。但我跑的Bis-Tris膠，而且是MES buffer。而marker在這兩種buffer（膠）中所代表的分子量是不同的。

apparent MW跟calculated MW有時候是相差很大的。
把我的體會貼到這里，衷心希望與大家一起探討。歡迎指正！最后祝大家實驗順利！