十、連接抗體的選用必須正確，否則可造成假陰性的現象。
免疫組化染色方法較多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，這時就必須要仔細地選擇好連接抗體，第一抗體有單克和多克隆炎分，連接抗體則要根據選用的抗體來進行，例如：第一抗體選用的是單克隆鼠抗人**抗體，連接抗體也要選擇相應的免抗鼠IgG，這樣才能連接上（目前生產廠家已生產出混合型抗體，即既適合于單克隆抗體，也適合于多克隆抗體。使用者不用擔心連接不上，隨便使用都可，但如果沒有訂購混合型的試劑盒，就必須注意的型號，使之完全適合所選用的抗體。）孵育的時間可在10分鐘，20分鐘或者30分鐘，一般在室溫中進行，如果室溫低于20℃以下，則可在37℃的孵育箱中進行。
十一、復合物的使用及孵育時間的確定。
各種方法有各自的復合物，如ABC法，復合物是卵白素和生物素結合的復合物，再帶有HRP，SP法，（LsAB法）的復合物是鏈雪菌素蛋白復合物，再帶有HRP，EV二步法的復合物則是二抗和三抗連接在一起的復合物，再帶上HRP，除此之外，根據水解底物的不同，可產生不同的顏色，例如：帶有HRP的酶，水解的底物一般為DAB產生黃棕色，帶AP的酶，水解的底物一般為AEC產生紅色。
十二、PBS的沖洗
免疫組化的染色過程，除了前面的處理和加入的抗體外，都在PBS的沖沖洗洗中度過，PBS沖洗的正確與否，也是導致最后結果的關鍵。
1.單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。
臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個缸內洗，這樣就會造成交叉污染，影響最后的結果。正確的做法是單獨地進行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機會。
2.溫柔沖洗，防止切片的脫落。
沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對準切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動，導致切片的脫落。
3.沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。
沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結合的各種物，使之不產生背景，此種做法一是浪費時間，二是很容易導致切片的脫落。切片的沖洗據實踐認為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結合的物質，無需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續2分鐘左右就完全足夠了。
4.PBS的PH和離子強度的使用和要求。
劉彥仿指出：中性及弱鹼性條件（PH7－8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解。［］免疫組化P56我們目前常用的PBS的PH在7.4-7.6濃度是0.01M，根據本室十幾年來的使用情況，認為該溶液價格便宜配制方面，使用效果好。
5.常用試劑的配制和使用。
在免疫組織化學的染色過程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因為切片在整個染色中，抗體的加，換，切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液。可見緩沖液在整個染色中都起至關鍵的作用，緩沖液的過酸或偏堿，都將影響染色的結果。下面將介紹有關方面的內容：
（1）緩沖液的配制
1.磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution.PBS）
Ⅰ液：0.2M Na H2PO4貯存液（PH7.6）
取一個具500ml的容量瓶，稱量15.60g NaH2PO4﹒12H2O倒入瓶中，加入少量蒸餾水使勁搖晃，直至溶解，加入蒸餾水湊足500ml。放于4 冰箱保存，配制時應注意的事項：
①在配制時，要先確定NaH2PO4的用量，因為該試劑有許多種類形，它們所含的水分子量不一樣，因而它們的用量也不一樣。如NaH2PO4含單個水分子時，配制時要稱取13.80g，而當含有2個水分子時，則需要稱取15.60g。
②配制時根據要求選取蒸餾水。因為蒸餾水有數種，單蒸餾水，雙蒸餾水，玻璃蒸餾水，去離子水。如沒特別要求，選用一般的蒸餾水配制則可。
③裝緩沖液的瓶子須用玻璃浸洗液泡洗過，以防污染，導致溶液中有雪菌生長。
Ⅱ液：0.2M NaHPO4貯存液(HP7.6)
取500ml的容量瓶，稱好17.91g NaHPO4﹒12H2O,倒入瓶中，邊加水邊攪拌，直至完全溶解再湊足500ml，貯存于4℃冰箱。
注意事項：
①該試劑也應注意有多種不同的含水分子量。
②該貯存液久放后可出現結晶。每次使用前，先取出回至室溫，搖晃其結晶溶解，也可用微波爐促其快速溶解，然后再用。
0.01M PBS工作液的配制：
取一2000ml的容量瓶一個，裝入已稱好的NaCt18g，加入少量蒸餾水讓其徹底溶解，再加入 Ⅰ液13ml，Ⅱ液87ml，加蒸餾水湊足2000ml，即可使用，即可使用該溶液在室溫下可保存3-4周，但以新配為佳。
PBS工作液配制完畢后，都要測其PH值，如果偏酸，可用氫氧化鈉來調試，如果偏堿可用HCl調試，測試有如下n種方法：
①PH測試筆測試，這是一種簡便、易行、結果較為準確的測試方法。當配制完PBS后，取一小杯，倒入配好的PBS，插入測試筆，打開開關，小屏幕上將可出現測出的PH結果。PH如果7.6不足，小量的可用0.2M
Na2HPO4調校，大量的可用氫氧化鈉調校。PH如果高于7.6，小量的用0.2M NaH2PO4調校，大量的可用HCL來調校。
②用試紙來測試：PH試紙有兩種，一種為廣泛PH試紙，范圍在1-14，另一種是精密試紙有各種各樣的范圍。但是，作為沖洗切片用的PBS，其精確度不需要十分精確，如配PH7.6時，測試時在PH7.5或7.7，都可使用。試紙測試PH值，停靠其反應的顏色來確定，十分簡便，一般的試劑都可用它來測試。
③儀器測試：對于要求較高，需較準確的PH值，須彩用儀器測試。
1.Tris緩沖溶液(Tris buffer solution,TBS)
①1N HCL ，濃HCL(雙重1.19)8.3ml，先取50ml蒸餾水，加入HCL再加水到100ml。
②0.5M Tris-HCL緩沖液(PH7.6)
取Tris(羥甲基氨基甲烷)6.57g，加入少許的蒸餾水攪拌，直至溶解，再加入1N HCL42ml，然后用蒸餾水湊足100ml，于4℃冰箱保存。
臨用時，將上述溶液10稀釋倍，即為0.05M工作液。
注意事項：
①配制1N HCL時，如果大量配制，HCL入水時可產生很大的熱量，對的所用的玻璃器皿應特別小心，以防突然產熱而使玻璃器皿爆裂。
②調校PH值時，可參考上述的三種方法