你說的應該是real time PCR吧,注意RT其實是逆轉錄reverse transcription的縮寫,和real time一定要分開來。
常說的qPCR,qRT-PCR,都是通過實時(real time)的方法,測定樣品中某個模版的起始量ct值
但是呢,由于之前RNA提取、反轉等步驟,各個步驟存在不同的效率,ct值并無法真實反應樣品中模版的絕對量,因此,需要一個內參來做為參考。
比方說,A基因的ct值,在a樣品中是18,在b樣品中是20,由于a b樣品存在RNA質量等等一系列不同,你無法直接就判斷這個基因在a樣品中的表達量是b樣品的4倍。
這時候,我們需要一個內參,假如內參ct值在a樣品中是14,而在b樣品中是15。由于內參的穩定性,在不同樣品中被認為是表達量一致的,因此,A基因的在ab樣品之間的-ΔΔct值是1,也就是表達量為2倍的關系。
這里,我們可以知道內參的作用,即通過測量內參,可以在后面分析過程中將不同樣品的起始量均一化。內參需要選擇在不同樣品中有穩定表達量的基因,這就是為什么內參經常選擇看家基因的原因。以小鼠為例,常用的內參有actin gapdh hprt等等。
當然,現在的很多觀點認為這些基因在不同組織中豐度也不同,例如gapdh,在線粒體含量高的組織中豐度高,很多人認為用基因組DNA做內參會更加靠譜,當然這是后話了,選擇gapdh無礙于現階段的實驗,如果覺得不靠譜,可以選擇兩個內參。
你所研究的物種,應該有人已經發表過相應的內參,直接上數據庫搜就可以了。
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