這里介紹的方法概括了表達載體的構建以及篩選功能蛋白的 RIDS 循環系統的構建。
3.1 RIDS 表達載體的構建
首先，需要準備含編碼 T7 啟動子、蛋白質文庫、連接子、RTA 和間隔區的 DNA 來構建 RIDS ( 圖 13.2A )。13. 3.1.1?13.3.3.3 部分詳述了這個過程。盡管理論上用聚合酶鏈反應（PCR) 制備雙鏈 DNA 是可行的，但是我們推薦用質粒來構建此 DNA，因為用 PCR 來連接不同部分（包括 T7 啟動子、蛋白質文庫、連接子、RTA 和間隔區)，很難保證不會引入非特異性擴增。在這個章節中，我們描述了構建 RIDS 載體的過程。由于采用標準的重
組 DNA 方法來構建載體，因為篇幅有限，DNA 的操作過程在此就不贅述了。
3.1.1 構建 pLRS 表達載體
首先，我們需要準備通用載體 pLRS，它像構建 RIDS 的 DNA —樣，能編碼 T7 啟動子、蛋白質文庫、連接子、RTA 和間隔區（圖 13.2 A ) 。 這個載體是基于 pET30a 載體（Novagen ) 的表達系統。我們通過將 cDNA 文庫或者隨機文庫插入到 pLRS 載體的位點可以很容易地構建 RIDS 蛋白質文庫。
用 DNA 合成儀合成連接子片段，并通過 T7 啟動子下游的 XbaI/XhoI 位點插入到 pET30a 載體中。連接子編碼了 NheI、噬菌體 M13 基因 II 的甘氨酸/絲氨酸富集序列、NcoI、Bam HI、Pstl 和 XhoI ( 順序從上游開始）。編 碼 RTA 的 DNA 是通過 PCR 從 pUTA 質粒中（獲贈于得克薩斯大學的 J.Robertus 教授）得到的，并且將其通過 NcoI/Bam HI 位點插入到甘氨酸/絲氨酸富集序列的下游。編碼間隔區的 DNA 來源于噬菌體 M13 基因 HI，并且通過 Bam Hl/Pst l 位點插入到 RTA 的下游。DNA 的序列 ( 不包括插入的 RIDS 蛋白質文庫序列）如圖 13.2 B 所示。
T7 啟動子和蛋白質文庫第一個 ATG 之間的 71-mer 序列來自于 pET30a 載體。RTA 上游靈活的連接子對于初生蛋白折疊成正確的三維結構，去除蛋白質文庫和下游 RTA 之間的空間阻隔是必需的。之前的研究表明，被選擇的蛋白質/mRNA 量強烈依賴于這個連接子的長度、組成和序列 [ 6，16，17] 。在目前的研究中，我們用 44 個含有甘氨酸/絲氨酸富集序列的氨基酸作為連接子。
去除 RTA 的空間阻隔是非常重要的。這是因為，在 RIDS 中通過引進 RTA 基因來達到穩定 mRNA-核糖體-蛋白質復合體的目的。除了這個連接子之外，可讀框 (ORF) 3' 端的間隔區也是非常重要的。這個間隔區作為錨來連接核糖體，必須有合適的長度才能占據核糖體的長通道 [ 18，19] ，并且允許初生 RTA 正確折疊而沒有任何空間障礙 [ 20，21] 。已經有報道，C 端至少需要 20?30 個氨基酸的間隔區來保持展示在核糖體上的酶的活性 [ 22，23] 。因此，核糖體展示系統上分離出的 mRNA 量會受到間隔子的長度，及其 3' 端二級結構的影響。我們在 ORF 的 3' 端分別引進一個長的和一個短的間隔區序列，比較它們在翻譯和選擇方面的影響。我們發現，在我們的系統里，長的間隔子（由噬菌體 M13 的全長基因 III 編碼的 404 個氨基酸）對于翻譯和選擇是不合適的。
所以，在我們所有的實驗中，我們用 121 個氨基酸的片段作為間隔子。
3.1.2 pStAv-R 和 pGST-R 載體的構建
為了校正提出的方法和 RIDS 的潛在應用性，我們在 DNA 文庫中引進編碼鏈霉親和素或 GST 基因作為模式研究（圖 13.3 A )。這些蛋白質經常被融合進新發現的蛋白質或者與之相互作用的分子上，成功地研究新發現的融合蛋白的功能性質[ 25?28] 。鏈霉親和素和 GST 分別結合到生物素和谷胱甘肽上，這種結合具有高親和性和特異性。因此，分離和確認蛋白質-核糖體-mRNA 復合體可能是很容易的。
從 pSTA ( 岡山大學的 M.Sisido 教授所贈）和 pGEX-4T-3 ( AmershamBiosicences) 質粒上分別切除編碼鏈霉親和素和 GST 的 DNA。用 PCR 方法將這些片段進行擴增，并分別連接到 pLRS 質粒的 XbaI/NhI 位點中，構建成 pStAv-R 和 pGST-R 質粒。
編碼鏈霉親和素或者 GST 的 DNA 的序列如圖 13.3B，13.3C 所示。
3.1.3 pStAv-mR 和 pGST-mR 質粒的構建
為了確認 RTA 有利于穩定核糖體復合體，在對照實驗中，我們通過點特異突變的方法改變了 RTA 功能氨基酸，得到 RTA 的突變失活基因。步驟如下：第 177 位的谷氨酸突變成谷氨酰胺；第 180 位的精氨酸突變成組氨酸；第 208 位的谷氨酸突變成天冬氨酸。這 3 個氨基酸的突變完全抑制了 RTA 的活性 [ 29，30 ] 。為了構建 pStAv-mR 和 pGST-mR 質粒，每個質粒（pStAv-R 或 pGST-R) 都采取標準的方法用 RTA 突變體基因替代 RTA 基因 [31]，引物如下：5'-TTG CAT CCA AAT GAT TTC AAAGC AGC AC A C T T CCA A T A T A T TA G GGA G AA ATG-3' ( 下畫線為 E177A 和 R180H 突變），以及 5'-G A T CCT AGC G TA A T T AC A C T T G AG G AT CCT AGCG T A A T T AC A C TT GA-3' ( 下畫線為 E208D 突變）。
3.2 選擇功能性蛋白的 RIDS 循環
采取標準的重組 DNA 方法，在含有隨機文庫或 cDNA 文庫（在我們的模式研究中，是 pStAv-R、pGST-R、pStAv-mR 和 pGST-mR ) 的 ORF 中，用 XhoI 酶切 ORF 的 3' 端產生線性 DNA。這個酶切反應是終止轉錄必需的。
3.2.1 DNA 文庫到 mRNA 的轉錄
在 T7RNA 聚合酶的作用下，DNA 被轉錄，含有一個帽狀結構類似物。在我們的模式研究中，在供應商（Epicentre Technologies Co.) 的推薦下，用 T7 Ampliscribe? 試劑盒轉錄 DNA。
( 1 ) 根據供應商的推薦，向 20 μl 轉錄混合物中添加 1 μg 線性 DNA。轉錄混合物含有 3 mmol/L 帽狀結構類似物、7.5 mmol/L rATP、rCTP、rUTP；0.75 mmol/L rGTP；10 mmol/L 反應緩沖液以及 AmpliScribe T7 酶溶液。
( 2 ) 在 37°C 靜置反應混合液 2?4 h，產生各種 mRNA ( 我們將這些 mRNA 分別命名為：StAv-R、pGST-R、pStAv-mR 和 GST- mR)。
( 3 ) 在轉錄反應后，用 DNase I 完全消化模板 DNA，因為殘余的模板 DNA 會影響后面的選擇步驟。
( 4 ) 根據供應商（Qiagen) 的推薦，用 RNeasy? mini 試劑盒純化 mRNA。
3.2.2 核糖體-mRNA-蛋白質復合體的親和選擇和 mRNA 的分離
制備 RNA 編碼文庫（在我們的模式實驗中，是 StAv- R、pGST- R、pStAv-mR 和 GST- mR) 和 Flexi 兔網織紅細胞裂解系統（Promega; 見注 1)。
( 1 ) 向 40 μl 翻譯混合物中添加 2 μg mRNA。翻譯混合物含有 33 μl Flexi 兔網織紅細胞裂解液、40 mmol/L KCl、40 μmol/L 總氨基酸混合液、40 U Recombinant RNasin 核糖核酸酶抑制劑（Promega)，用蒸餾水定容體積到 50 μl。不要添加 DTT 和 Mg2+ 離子（見注 1)。
( 2 ) 在 30°C 靜置 20 min。在我們的研究中，3 種 mRNA 體系被翻譯（每種體系用 2 μg RNA，它們分別是：以 1 :1 比例混合的 mRNA，以及作為對照的編碼鏈霉親和素或者 GST ( StAv-R 和 GST-R) 的 mRNA；見注 2）。
( 3 ) 翻譯之后，添加 1 ml 適當的結合緩沖液 [ 見 13.2 ( 13 ) ] 和配基固定珠子。在我們的研究里，添加 10 μl 生物素瓊脂糖或者谷胱甘肽珠子的終止液（見注 3)。
( 4 ) 在 4°C 靜置 1 h，溫和地攪拌有利于結合反應。盡管靜置在室溫下也是可以的，但是我們推薦 4°C。因為在反義轉錄 PCR (RT-PCR ) 里有時會檢測到非特異性的結合(見注4)。
( 5 ) 在結合反應后，用 500 g 的轉速離心 1 min 來沉淀配基固定珠子。
( 6 ) 去掉含有未結合 mRNA 和蛋白質的上清液。
( 7 ) 添加 200 μl 漂洗液 [ 見 13.2 (13)]，溫和地混合 30s。
( 8 ) 用 500 g 的轉速離心 1 min 來沉淀配基固定珠子。
( 9 ) 去掉含有未結合 mRNA 和蛋白質的上清液。
( 10 ) 重復漂洗步驟（7?9 ) 2 次或者 3 次。
( 11 ) 添加 100 μl 洗脫緩沖液 [見 13.2(16 ) ] ，室溫用力地搖動 30 min，從沉淀配基固定珠子上分離出結合的 mRNA。
( 12 ) 根據供應商的推薦，用 RNeasy? 試劑盒純化洗脫下來的 mRNA，用真空泵濃縮純化后的 mRNA。
3.2.3 反義轉錄
用 RT 進行反義轉錄反應。在我們的模式研究中，根據供應商的推薦，用 ReverTra Ace (Toyobo) 進行反義轉錄反應。
( 1 ) 將純化后的 mRNA、4 μl 10 μmol/L RT 引物、每種 10 mmol/L dUTP 2 μl、4 μl 5X RT 緩沖液，用蒸餾水定容到 18 μl，根據供應商的推薦，不加 RNase 抑制劑和 ReverTra Ace。RT 引物用來（5'-G T G T A G C T T T G C A C A G T G G C -3' ) 識別 RTA 序列的上游部分。
( 2 ) 將混合物在 65°C 下放置 5 min 變性后，迅速放到冰上冷卻。
( 3 ) 向混合物中添加 1 μl RNase 抑制劑和 1 μl ReverTra Ace。
( 4 ) 42°C 靜置 1 h 進行反轉錄。然后 99°C 靜置 5 min 將酶失活。
3.2.4 聚合酶鏈反應
用熱穩定 DNA 聚合酶進行 PCR 反應。在我們的模式研究中，根據供應商的推薦，用 KOD Dash ( Toyobo) 進行 PCR 反應。
( 1 ) 將 20 μl cDNA、10 μl 10X PCR 緩沖液、每種 2 mmol/L dUTP 10 μl、1 μl 10 mmol/L RT ( 作為下游引物），以及 2 μl 10 μmol/L 上游引物，用蒸餾水定容到 99 μl，不添加 KOD Dash。上游引物（ 5'-AAT TTT GTT TAA CTT GAA GGA G-3'）用來識別 T7 啟動子序列的下游部分。
( 2 ) 將混合物在 98°C 下放置 2 min 變性后，迅速放到冰上冷卻。
( 3 ) 添加 0.5 μl KOD Dash。
( 4 ) 運行 PCR 程序（98°C 1 min；然后 98°C 10s，55°C 2 s，72°C 30s，循環 15?30 次；最后 72°C 10 min )。98°C 靜置 1 min。 展開 | 
