光纖式在體熒光顯微成像系統在動態觀測活體動物腦內神經元中的應用
中國上海復旦大學腦科學研究院、醫學神經生物學國家重點實驗室的石 瑩，陳露嵐，姜 民等人在生理學報 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2012, 64(6): 695–699 發表文章對建立大鼠腦內神經元的在體顯微熒光連續觀察的實驗方法進行研究。研究開始將含有綠色熒光蛋白的重組病毒載體(Ubi-GFP)微注射到Sprague Dawley (SD)大鼠大腦皮層區，7天后用微創手術將光纖探頭植入動物腦內目標位置，使用在體熒光顯微成像技術觀察到微注射區GFP標記神經元的特異性熒光信號。隨后對大鼠腦組織行冰凍切片，熒光顯微鏡對切片的觀察結果驗證了在體熒光顯微成像實驗中觀察到的熒光信號。該方法既保證了在體實驗中動物處于生理狀態，又滿足了體內神經組織熒光顯微水平成像的要求，可以用于動物腦內神經元熒光信號的在體追蹤記錄，為在體神經科學實驗提供了有效的技術保障。
應用在體熒光顯微成像技術觀察大鼠腦內神經元
將大鼠用7% 水合氯醛(0.6 mL/100 g) 經腹腔注射麻醉，剃毛并固定于立體定位儀上。暴露前期的顱骨孔道，打開在體式熒光顯微成像記錄系統，將在體式熒光顯微鏡直徑為650 μm 的柔軟光纖ProFlex 垂直插入大鼠腦內，穿過腦膜，垂直進針1.8mm 達PtA 區的微注射部位，通過488 nm 的激光器激發，采集信號波段為500~650 nm，采集頻率為12 幅/s 記錄在體熒光影像( 圖1)。
2 結果
2.1 大鼠腦內神經元在體熒光顯微成像
通過在體熒光成像系統可以實時采集到光纖探頭所在目標位置的熒光影像。在大鼠腦內的微注射部位，微調光纖探頭，選擇兩個視野進行觀察并各記錄10 min 內GFP 標記神經元的熒光信號的動態變化。使用IC-Viewer 軟件，可將記錄到的數據以影像或圖片格式導出。圖2A 和B 顯示的是從同一樣本采集的兩段數據中分別導出的時長為10 s 的6張連續截圖，在圖中可觀察到相應時間點處多個被GFP 標記的腦內神經元的形態，神經元胞體的GFP熒光信號較明顯。在記錄的時間段內，GFP 標記的神經元形態未見明顯變化。
探頭式在體熒光顯微成像技術是通過對微細光纖探頭和激光掃描兩個技術的組合[8]，從而實現實時追蹤記錄動物體內信號動態變化過程的功能。而且，由于探頭的直徑僅650 μm 且材質較柔軟，可滿足動物微創手術的要求。探頭是由近3 萬根柔軟的光纖組成的( 圖4)，其觀測范圍達600 μm × 500μm， 軸向分辨率為15 μm，橫向分辨率為5 μm，敏感性較高，因此可以在神經科學領域內用于動物腦內神經元信號的在體追蹤記錄[9]。在體熒光顯微成像技術通過488 nm 的激光器激發，采集信號波段500~650 nm，采集頻率為12 幅/s 記錄在體熒光影像。該儀器設備所采集的信號編碼是13 bits，通過軟件可以導出png、bmp、jpeg 等多種格式的圖片以及mpeg、mhd (raw format) 等格式的影像。通過在體熒光顯微成像技術，實時地觀察到大鼠腦內GFP 標記的神經元的形態。10 s 內的連續截圖顯示，雖然活體動物的呼吸、血管跳動等生理因素對影像的穩定性會產生細微的影響，但目標神經元的短時間內截取圖像仍相對比較穩定，神經元胞體熒光信號比較清晰，且與文獻報道非常相符[5]。這也提示在記錄過程中未產生明顯的光毒性。將同一大鼠的腦組織進行冰凍切片，在熒光顯微鏡下進行觀察，觀察到了GFP 標記的神經元，也進一步證實了在體熒光顯微成像技術的客觀有效。
結果表明，探頭式在體熒光顯微鏡可以穩定地記錄一段時間內特定視野的神經元形態，因此可以與立體定位技術結合，用于神經元發育、神經元遷徙等研究的觀察手段。探頭式在體熒光成像技術因其實時采集圖像信的功能特點，結合圖像分析軟件，除了可以進行在體神經元的形態學實時觀察，還可以對體內的快反應現象如鈣離子流變化等進行動態數據采集[5]，也可以對神經元以外的組織結構如血管指標等進行分析，甚至與在體的其它生理信息進行同步采集。配套使用相應的切口固定配件，可以完成動物清醒狀態下的數據記錄。
另外，鑒于光纖式探頭的激發波長為488 nm，在光遺傳學研究中，也可用于精準定位激活ChR2 光敏蛋白。
綜上所述，光纖式在體熒光顯微成像技術為我們神經科學實驗提供了更大的拓展空間。
本文節選自復旦大學腦科學研究院、醫學神經生物學國家重點實驗室的石 瑩，陳露嵐，姜 民等人在生理學報 Acta Physiologica Sinica, December 25, 2012, 64(6): 695–699 發表文章