光遺傳學在生命科學領域的應用

光遺傳學技術是一種結合遺傳學與光學技術，在復雜如自由活動個體的生物系統中實現定點的、快速的控制某一精確定義的生物學過程的技術。通過引入光敏感蛋白的受體或通道蛋白至特定組織特定細胞中，并經特定參數的光信號控制，光遺傳學技術能夠關閉或激活某一類細胞的生物學功能，從而實現在細胞、環路、器官和個體等多個層面研究該細胞及其環路的生物學機制與功能性意義。

在神經科學的研究中，一個重要的問題是腦是如何工作的，在環路層面來說，就是各種類型的細胞是如何構建成神經環路進行運算和信息處理并發揮生物學功能，控制個體情緒、意識和行為的。在過去，生物學家曾經使用過多種干擾方法，與光遺傳學方法的比較如下表：

神經環路研究的幾種干擾策略比較

雖然電刺激可逆，快速、定點等特征與光遺傳技術沒有差別，但是電刺激在刺激條件可控性、重復性、簡易性方面要比光遺傳學技術難得多，一個訓練有素的電生理操作人員也不能保證每一次實驗都能夠快速尋找的目標細胞進行有效的刺激。此外，光遺傳學技術能夠很好的應用在自由活動的動物上，這與需要麻醉條件進行刺激的電策略相比有不可替代的優勢，因此這幾年采用光遺傳學進行神經環路的結構和功能研究報道呈井噴式增長。

光遺傳學技術最重要的一個部件就是能夠感受光刺激并激發或關閉某一生物學過程的蛋白。通常該蛋白含有三個結構域，一是光敏感受器結構域，能夠感受不同波長的光刺激，二是跨膜結構域，使蛋白定位在細胞膜上，三是功能性結構域，它或是通道，或是離子泵，或是某種受體結構域。按照功能性結構域不同，目前光控蛋白主要分為以下四種類型：

（1）光敏陽離子通道（ChR），受光刺激后通道開放并主要介導鈉離子和鈣離子的內向流動，可造成神經元去極化興奮；

（2）光敏陰離子通道(HR)，受光刺激后通道開放介導氯離子內流，可造成神經元興奮性抑制；

（3）光敏質子泵(BR/PR)，受光刺激后通道開放向外泵出氫離子,可導致興奮性抑制；

（4）光敏G蛋白偶聯受體(OptoXR)，受光刺激后發生構象改變誘導胞內G蛋白活化和下游信號事件。

除了功能性結構域的不同類型，光敏通道/受體還有兩個重要的光學屬性，對于光學控制非常重要。第一個參數是激發光譜，每一種亞型的光敏蛋白都有一個特定的激發光譜，選擇最優的激發波長能夠最有效的激發光敏通道/受體，由于激發波長的不一樣，在一個系統中可同時進行多個波長的刺激，從而實現不同的控制效果。其二是時間常數toff，即通道關閉時間，該時間決定了光通道/受體的開放時間和脫敏時間，影響光脈沖的時間和頻譜設定。

在光遺傳學基因導入策略上，病毒是目前使用最為常見和廣泛的方法，因為病毒導入技術具有快速、靈活多樣、不受腦區限制等諸多優勢。目前光遺傳研究中使用較多的是慢病毒和AAV病毒，腺病毒和HSV也有使用。后兩者由于安全性問題，使用的不是很多。在病毒導入技術的應用上，采用光遺傳學研究神經系統功能發生如下兩個演變。

一、病毒種類的探索

開始的時候慢病毒和AAV都有較多使用，而且因為慢病毒包裝相對簡單在早期使用更廣泛，不過現在AAV似乎更加受歡迎。經過很多例子分析，AAV相對于慢病毒有如下三個主要優勢：

（1）AAV病毒更容易獲得高滴度，因而能夠取得更好的感染效果；

（2）AAV的免疫原性較低，因此引起的炎癥反應較少，對組織本身的狀態影響更小；

（3）AAV基因組整合度低，具有更好的生物安全性。而在啟動子兼容和基因裝載上，AAV和慢病毒旗鼓相當，因此AAV得接受度逐漸擴大了。

二、特異性和精確度的追求

光敏感通道/受體基因的表達最開始是直接受常規啟動子驅動，這樣的策略能夠有效感染局部腦區，不過由于缺乏較好的細胞特異性，往往在接受光刺激時，不同類型的神經細胞都能被同時激活，從而影響了對響應的正確判斷。病毒介導的光遺傳學導入與基因工程小鼠的組合策略滿足了研究人員對光控制特異性和精確度的要求。這種組合策略本身也經歷了兩次進步。第一次進步是采用Cre重組酶細胞特異性表達的小鼠與受loxP元件控制的光敏感基因的表達。

由于現在不同啟動子驅動Cre重組酶表達的基因工程小鼠特別多，研究人員只需要準備常規的受loxP元件控制的光敏感基因病毒，便可通過注射Cre小鼠的方式實現細胞特異性表達。第二次進步是制作受loxP元件控制表達的光敏感基因的基因工程小鼠。通過病毒導入受特異啟動子驅動的Cre表達基因序列，實現基因工程受體鼠和病毒導入Cre基因的雙重控制的細胞特異性，從而實現更為精確的表達控制，提高了光遺傳學研究結果的純凈度和可靠性。