雙重或多重標記是利用免疫學和細胞化學原理，在同一張切片上同時采用或先后采用不同顏色的熒光色素或酶促產物，或采用不同直徑大小顆粒膠體金來原位標記兩種或兩種以上抗原-抗體復合物，達到在同一細胞或亞細胞水平顯示不同抗原成分（定性、定位、定撤），分析不同抗原成分相互間功能的增消關系，操作遵循的原則與要求同單標免疫組化方法。其組合方法多種多樣，可根據各實驗室現有試劑進行組合，也可購置較為成熟的商品化試劑盒。另外，二種抗體間的種屬和表達部位的搭配也很重要。
常用方法可按標記物分為三種類型。
（1）免疫熒光雙重標記
（2）免疫酶雙重標記
①單酶雙底物：HRP-DAB/H2O2（棕色）與 4-CN/H2O2（藍色）或鎳-鈷 DAB，AP-萘酚 AS-MX 磷酸鹽/堅固紅（紅色）與堅固藍（藍色）；
②雙酶雙底物：HRP-DAB/H2O2（棕色）與 AP-萘酚 AS-MX 磷酸鹽/堅固藍（藍色）等。
（3）混合雙重標記如酶標記與熒光素標記配伍；膠體金（銀）標記與熒光索標記配伍；膠體金（銀）標記與酶標記配伍等。
雙重或多重標記方法也可按標記抗體分為直接法、間接法、復合物法、聚合物擴增法等；按抗體制備動物來源分為異種動物抗體法與同種動物抗體法；按制備抗體構型分為單克隆抗體與多克隆抗體混合法、單克隆抗體亞類型混合法（如 IgG 與 IgM 亞類組合、IgG1a 與 lgG2b 亞型組合）等；按有否洗脫去除第一重抗原-抗體復合物分為洗脫法與非洗脫法。
一般多采用熒光或酶標間接法，混合試劑，不洗脫。光鏡以雙熒光或雙底物酶標記為多，顏色區別。
來源：免疫組織化學實驗技術及應用
| 試劑、試劑盒 | 石蠟切片 |
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| 實驗步驟 | 1. 石蠟切片（貼片前的載玻片應預涂不含有熒光色素的黏片劑），厚 5 μm，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，人 PBS（pH 7.4，0.01 mol/L）。 2. 1％ 人血清白蛋白（HSA）孵育 10 min（亦可用 10％ 正常羊血清代之），不洗。 3. 抗 ACTH 血清（McAb）1:200，孵育 30 min，37℃，濕盒。 4. 0.05 mol/L TBS（pH 7.4，內含 1％ Triton X-100，下同）洗，10 min×3。 5. 羊抗鼠 IgG-TRITC 1:100，濕盒，室溫避光反應 1 h。 6. 0.05 mol/L TBS（pH 7.4）洗 10 min×3（第一重 ACTH-TRITC 標記染色已完成）。 7. 切片逐級乙醇脫水，二甲苯透明，空氣干燥后，置于裝有多聚甲醛粉末的密閉容器內，放在 80℃ 烤箱或溫箱內以甲醛蒸氣固定 2～4 h，使第一重染色中二抗的不飽和抗原結合部位（Fab）失活。 8. 切片以 TBS 洗 5 min×4。 9. 1％ HSA（或 10％ 正羊血清）孵育 30 min，室溫，濕盒，不洗。 10. 抗 GH 血清（McAb）1:400，孵育 30 min，37℃，濕盒。 11. 0.05 mol/L TBS（pH 7.4）洗 10 min×3。 12. 羊抗鼠 IgG-FITC 1:100，濕盒，室溫避光反應 1 h。 13. 0.05 mol/L TBS（pH 7.4）洗 10 min×3（第二重 GH-FITC 標記染色完成）。 14. 緩沖甘油封片。熒光顯微鏡下分別以 546 nm 及 490 nm 波長的激發光觀察切片組織內 TRITC 及 FITC 所標示的 ACTH 及 GH 抗原（TRITC-ACTH 陽性細胞呈紅色，FITC-GH 陽性細胞呈亮綠色）。 15. 觀察及攝影。用彩色底片對切片同一部位用 546 nm 及 490 nm 波長激發光分別作兩次曝光，即可在同一張照片上顯示不同顏色標示的 ACTH 與 GH 兩種抗原。 展開 |
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