本方法的核心部分是醫科院基礎所的生化脂蛋白組的吳剛老師所創，我在其基礎上進行了一些改動，主要是DNA回收上采取了更簡單的方法。（本方法最適用于雙酶切制作片斷并進行克隆的情況。對于分步酶切制作片斷，也可以使用本方法，但需要加倍起始酶切DNA的量。）
一、片斷平移的克隆（也適用于多片斷連接）
簡介：將用作載體的質粒A（制作大片斷）酶切3μl
，要切出小片斷的質粒B酶切7μl；瓊脂糖回收膠電泳；切膠回收來自質粒A的大片段，和來自B的小片斷，并回收到一管中；酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥；加入8μl水、1μlligase
Buffer、1μl ligase ，4℃過夜；次日轉化涂板。
酶切
配置可酶切共10μl質粒的酶切反應體系（雙酶切）：
（提示 在克隆設計時盡量使用好切的內切酶<通常是效價高、便宜量大的酶>，且注意這兩個酶有比較兼容的Buffer，即在這種公用Buffer中，兩酶的效力變化不大<至少保持60%的活性>。酶切體系根據需要，可加入BSA。）
酶切體系
混勻
37℃，酶切3小時。
（提示 關于酶量的問題。通常的內切酶效價在10U/μl左右，3μl內切酶相當于30U，足夠切10μl的質粒。因為通常小提質粒的濃度在200－600ng/μl，一般濃度達不到1μg/μl。根據1U酶切1μg質粒的原則，這一酶量是足夠的。）
1%瓊脂糖回收膠回收（碎膠、酚氯仿抽提法）
1. 酶切產物加入10％量的上樣Buffer，混勻。使用1%的瓊脂糖回收膠，電泳回收酶切產物。
2. 用手術刀切下所需要的大片斷（載體）和小片斷（插入片斷），收入一個1.5ml離心管中。（提示: 切膠前，需用分別含酒精、NaOH和雙蒸水的紙巾擦拭凝膠接觸的臺面，以防污染。 手術刀要火焰消毒，而后切膠回收。）
3. 12000rpm 1分鐘，將凝膠甩到管底。 -20℃ 冰凍20分鐘。
4. 取200μl Tip 頭兩只，在酒精燈上稍烤化Tip頭尖端，兩Tip頭尖相對來回相接觸，在Tip頭頂部制成直徑3mm左右的平頭，準備用于碎膠。
5. 從-20℃取出凍結的凝膠，立即使用200μl槍套上平頭Tip頭，搗碎凝膠。（提示 200μl的槍足夠粗壯，不要用100μl的槍，小心折斷！！！ 乘凝膠比較硬時就開始碎膠，輕而頻率高地搗碎凝膠）
6. 凝膠管中加入500μl雙蒸水，蓋緊，振搖200下。
7. 加入500μl Tris飽和純酚，蓋緊，振搖200下。 12000rpm 4℃ 離心15分鐘。
8. 在一新1.5ml 離心管中加入 500μl 氯仿：異戊醇（24：1），將步驟7的上清加入本步驟離心管中。蓋緊，振搖200下。 12000rpm 4℃ 離心5分鐘。
9. 在一新1.5ml 離心管中加入 900μl 預冷 無水乙醇、20μl
3M的醋酸鈉。將步驟8的上清小心加入本步驟離心管中。顛倒數次混勻。12000rpm 4℃
離心15分鐘。（提示吸取步驟8中的上清時，千萬不要將有機相吸入，寧可放棄一些上清，否則影響后面的連接反應。另外，本方法使用的醋酸鈉量較小，但足夠沉淀核酸，并且無需洗鹽。）
10. 棄上清，將離心管倒置于干凈吸水紙巾上5分鐘。室溫下吹風干燥。（提示 可將試管至于超凈臺吹風干燥。如果管底有較多液體聚集，可蓋好管蓋后，輕彈管底數次，將液體分散掛在管壁上，再打開管蓋吹風。）
連接
向回收DNA的試管中加入8μl 雙蒸水，蓋緊，彈擊管底使液體盡量接觸管壁。瞬時離心將液體甩到管底，再加入1μl ligase
Buffer，1μl T4 ligase（連接酶）。彈擊管壁混勻，瞬時離心將液體甩到管底。 置4℃過夜。 （提示 Ligase
Buffer應該在首次融解后分裝，每管可2-3μl，-20℃存儲。 4℃過夜可獲得最多的轉化克隆。）
二、PCR產物接入質粒的克隆
簡介： 取100μl
PCR產物，酒精沉淀、干燥，直接加入酶切體系酶切；將用作載體的質粒A（制作大片斷）酶切3μl；切膠回收來自質粒A的大片段，和來自PCR產物的小片斷，并回收到一管中；酚氯仿法回收DNA，酒精沉淀，干燥；加入8μl水、1μlligase
Buffer、1μl ligase ，4℃過夜；次日轉化涂板。
PCR產物回收
1. 制備100μl PCR產物。
2. 將100μl PCR產物加入一1.5ml離心管中，再加入400μl雙蒸水，顛倒混勻。加入 900μl 預冷 無水乙醇、20μl 3M的醋酸鈉。顛倒數次混勻。（提示 本方法使用的醋酸鈉量較小，但足夠沉淀核酸，并且無需洗鹽。）
3. 4℃靜置30分鐘，以利于核酸沉淀。
4. 12000rpm 4℃ 離心15分鐘，沉淀核酸。
5. 棄上清，將離心管倒置于干凈吸水紙巾上5分鐘。室溫下吹風干燥。（提示 可將試管至于超凈臺吹風干燥。如果管底有較多液體聚集，可蓋好管蓋后，輕彈管底數次，將液體分散掛在管壁上，再打開管蓋吹風。）
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