試劑、試劑盒 氯仿-異戊醇酚：氯仿-異戊醇（25:24:1)氯化鋰 (LiCl10mol L)酚（Tris-飽和）TE 緩沖液乙醇堿性磷酸酶平末端限制性內切酶和反應緩沖液克隆載體
儀器、耗材 水浴鍋真空干燥機 瓊脂糖凝膠電泳設備和試劑
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
氯仿-異戊醇（24:1)
酚：氯仿-異戊醇（25:24:1)
氯化鋰 (LiCl,10mol/L)
酚（Tris-飽和），pH8.0
TE 緩沖液（5 mmol/LTris-HCl、pH8.0，0.1mmol/LEDTA)
乙醇,100%
2. 酶和酶緩沖液
堿性磷酸酶（0.1~0.2U)(用于方法 B)
商業上的分子生物學級別的堿性磷酸酶通常含有核酸酶的污染。推薦使用細菌堿性磷酸酶，它已經過純化除去了污染的核酸酶，并且在 PCR-Script 檢測中有重要的質量控制的作用。
平末端限制性內切酶（10~20U) 和反應緩沖液，即 SrfⅠ或 SmaⅠ通用緩沖液，10X(用于方法 B, 需要與使用的限制酶和堿性磷酸酶一致）（1mol/L 乙酸鉀，250 mmol/LTris-乙酸鹽、pH7.6，100 mmol/L 乙酸鎂，5 mmol/L/β-巰基乙醇,100ug/mlBSA)
3. 核酸和寡核苷酸
克隆載體（1ug)
4. 專用設備
3 個水浴鍋，在限制酶和堿性磷酸酶處理前（方法 B) 把水浴調到相應適當的溫度，另外一個調成 65°C
真空干燥機
5. 額外項目
可選擇：瓊脂糖凝膠電泳設備和試劑，包括溴化乙錠
二、方法 A—準備雙向克隆載體.
平末端克隆程序應用含有平末端的克隆載體去捕獲 DNA 片段來進行雙向插入。因此，平末端載體不需要核苷酸突出端用來克隆插入片段。隨后，平末端 DNA 片段，比如 PCR 產物，可以直接克隆進這些載體。平末端克隆本質上是一個效率很低的方法，一般重組插入占整體轉化子不到 10%[見圖 28-2(a)]。通過向連接反應體系中加入一個限制酶來提高效率，正如 PCR-Script 方法 [見圖 28-2(b)](Liuand Schwartz1992)。
1. 在如下 20ul 反應混合物中，用適當的平末端限制性內切酶消化 1pg 載體 DNA。
載體 DNA(lug/ul) 1ul
限制酶（10U/ul) 1ul
反應緩沖液，10X 2ul
H20 補充到 2ul
2. 在適當的溫度下溫浴消化1h。
可以選做：取 1ul 消化產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測載體 DNA 線性化程度.
3. 用酚/氯仿抽提消化產物，然后加入等體積的 Tris 飽和酚（pH8.0)，劇烈振蕩，將上層液相轉移到一個新管中。向試管中加入等體積的氯仿，振蕩。簡短離心，小心地將上層液相轉移到一個新管。
4.65°C 熱處理抽提出來的 DNA20 min, 除去殘留的氯仿（氯仿的沸點是 55°C)。
5. 向第 2 步中的 DNA 抽提物中加入 0.1 倍體積的 10mol/L LiCl 和 2.5 倍體積冰預冷的 100% 乙醇，用來沉淀 DNA。輕輕地混勻，在室溫下 12000 g 離心 10 min。
6. 離心后，小心倒出上清液。在真空下抽干 DNA 沉淀 10min。
7. 用 5ulTE 緩沖液重溶 DNA, 將已經預先消化好的雙向克隆載體置于-20°C 保存。
當用 50ulTE 緩沖液重溶 DNA 時，消化好的 DNA 最終濃度應該大約是 10ng/ul。
三、方法 B-------定向克隆載體
人們根據已知的 T4DNA 連接酶和大腸桿菌轉化的特性，開發出定向克隆的方法，這個方法不需要向引物中加入額外的堿基。首先，T4DNA 連接酶同時需要 5'端磷酸和 3'端羥基基團來有效地連接 DNA 的兩條鏈。其次，線性 DNA 轉化 rcBC 缺陷的大腸埃希菌寄主效率非常低（大約降低了 4 個數量級）。因此，理論上來說通過制備一個單磷酸化載體和一個單磷酸化的插入片段就可以實現定向克隆。插入片段按期望的方向連入載體則會產生一個單切刻環狀分子；如果在非期望的反方向插入，則連接反應將產生一個線性分子，它轉化大腸桿菌的效率非常低。用一種限制性內切酶處理載體，再用堿性磷酸酶除去暴露在外的 5‘磷酸，隨后用另一種限制性內切酶消化載體，如此便產生了一個單磷酸化的載體。簡并性限制性內切酶也可以用于這種方法。
正確的 DNA 序列操作使得酶處理過的載體能夠在 PCR-Script 類反應中使用，因為自連載體容易被連接反應體系中的內切酶消化，而且報告基因的閱讀框架是保守的。因為載體自連后會產生一個限制酶位點，不可高估使用一個高度純化的酶來進行定向和雙向克隆操作的必要性。必須檢測核酸酶的污染并且在進行上述實驗以前將核酸酶的污染除去干凈。一個特別的例子，應用 PCR-Script Direct 定向克隆方法，酶切處理了一個 SK(+) 多克隆位點，使得它同時含有一個 Srf Ⅰ(5'-GCCC|GGGC-3') 位點和一個 SmaI(5'-TCCC 丨 GGGC-3', 下劃線表示 Sam Ⅰ目標序列）位點（Weiner1993)。載體首先用 Srf Ⅰ消化，然后用一個堿性磷酸酶除去磷酸，再用 SmaI 進行第二次消化。除去 Srf Ⅰ-Sam Ⅰ消化后產生的短 DNA 片段。Srf Ⅰ位點仍然得到保留（見圖 28-3)。因為閱讀框是保守的，仍然能夠使用表型選擇。單磷酸化載體可以按下述的通用指南制備。
1. 按如下體系，用第一個平末端限制性內切酶（Srf Ⅰ) 消化適當的載體 DNA。
載體 DNA(1ug/ul) 1ul(原文為 1ug/ul。—編者改）
限制酶（10U/ul) 1~2ul
通用緩沖液*，l0X 2ul
H20 補充到 50ul
2. 在適當的溫度下溫浴 1h。
可選做：取 1ul 消化產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測載體 DNA 線性化程度。
*使用能夠同時應用于第一個限制性內切酶消化及堿性磷醭酶去磷酸化反應的緩沖液優化載體 DNA 的酶處理過程。
3.65°C 溫浴 20 min 使限制酶失活，然后置于冰上。
4. 直接向熱處理過的混合物中加入堿性磷酸酶（0.1~0.2U)，再按操作指南所述溫浴。
5. 用酚/氯仿抽提已經被限制酶消化且被堿性磷酸酶處理過的質粒 DNA。然后加入等體積的 Tris 飽和酚，劇烈振蕩，將上層液相轉移到一個新管。向試管中加入等體積的氯仿，振蕩。將上層液相轉移到一個新管。65°C 熱處理抽提出來的 DNA20 min, 除去殘留的氯仿。
6. 建立第二個 30ul 的限制酶消化體系，它含有已被堿性磷酸酶處理過的載體 DNA 和下游的平末端限制性內切酶，即加入 15ul 已經用酚/氯仿抽提過的 DNA、H20、1X 通用緩沖液和酶（10~20U)。在推薦的溫度下溫浴消化 lh。
7.65°C 溫浴 20 min 使第二個限制酶失活，然后置于冰上。
8. 加入 0.1 倍體積的 10mol/LLiCl 和 2.5 倍體積冰預冷過的 100% 乙醇，以沉淀單磷酸化 DNA。輕輕地混勻，在室溫下 12000 g 離心 10min。
9. 離心后，小心倒出上清液。在真空下抽干 DNA 沉淀 10min。
10. 用 25ulTE 緩沖液重溶 DNA。
當用 25ulTE 緩沖液重溶 DNA 時，單磷酸化的 DNA 最終濃度應該大約是 10ng/ul。將已經單磷酸化的定向克隆載體置于-20°C 保存備用。