免疫共沉淀

實驗概要

本實驗以植物葉片為試材介紹了免疫共沉淀的基本方法。

主要試劑

50uM雌激素，液氮，提取緩沖液TBS(50mM Tris-Cl，0.15M NaCl，pH 7.4，1mM PMSF，5mM Benzamidine)，glycine-HCl，TBS，洗脫緩沖液(TBS，0.5mg/mL 3xflag，0.1-1% triton X-100)

主要設備

研缽，高速離心機

實驗材料

5-6周大的野生型或者HopAll -FLAG轉基因植物

實驗步驟

1. 5-6周大的野生型或者HopAll -FLAG轉基因植物在50uM的雌激素誘導12小時。

2. 取植物葉片液氮速凍后研磨，加入提取緩沖液TBS(50mM Tris-C1，0.15M NaCl，pH 7.4，1mM PMSF，5mM Benzamidine)研磨直至均勻。

3. 14000rpm于4℃離心10分鐘，取上清。

4. 100000g于4℃超離心60分鐘，取上清。

5. 取anti-flag M2(SIGMA ) agarose用glycine-HCl (pH 3. 5)洗1次，TBS洗3次。

6. 將anti-flag M2 agarose加入蛋白溶液，于4℃孵育4小時。

7. 500g于4℃離心5分鐘收集agarose。

8. 加入1mL TBS，于4℃ 8000g離心40秒，如此反復洗5-10次，棄上清。

9. 加入50-100ul洗脫緩沖液(TBS，0.5mg/mL 3xflag，0.1-1% triton X-100)于4℃洗脫。

l0. 取樣蛋白電泳，用Western檢測蛋白的存在。