免疫核糖核酸的制備及鑒定實驗

實驗概要

本實驗通過免疫動物，制備了免疫核糖核酸(iRNA)，并進行了鑒定。

實驗原理

iRNA是用某種抗原免疫動物后，從免疫動物的免疫活性細胞中提取出來的RNA。它具有傳遞相應抗原特異性免疫信息的能力，因而注入體內后，可發揮對該抗原的免疫清除作用。

iRNA的免疫學作用機理目前尚無定論，一般認為iRNA具有直接模板作用，即iRNA以mRNA的形式在受體細胞中起模板作用，從而合成與免疫反應有關的蛋白質，使正常非致敏的淋巴細胞轉變成致敏淋巴細胞。另外，也有人認為iRNA具有逆轉錄作用、免疫調控作用及“超抗原”作用等。

實驗步驟

1. 動物免疫

1) 抗原制備：根據欲制備的免疫核糖核酸的目的不同，采用不同的抗原。

如欲制備抗乙肝iRNA，可采用乙肝疫苗，每20μg乙肝疫苗，加1ml弗氏不完全佐劑(液體石蠟8ml加羊毛脂2ml)及卡介苗45mg，充分混勻并乳化合格后備用。

2) 動物選擇及免疫：大量制備時，多選用綿羊或山羊，小量制備時，可選用家兔或豚鼠，所用動物應健壯無病。免疫方法為背部及兩肘窩多點皮下注射上述乳化疫苗，同時腹腔注射10μg乙肝疫苗，其后每周腹腔注射20μg，共4次。

3) 效價測定及臟器采取：第4次免疫后1周，靜脈采血，分離血清，用ELISA測效價，如效價在1:800以上即合格。處死動物，采取脾臟及淋巴結，置-20℃保存備用。

2. iRNA的提取(熱酚法)

1) 粗提：將脾臟及淋巴結去掉結締組織及被膜，用生理鹽水洗凈，切碎，洗去血液，擠干。每200g組織加200ml鹽水，置高速組織搗碎機中制成勻漿(以8000～10 000r/min勻漿兩次，每次1～2min)。

向上述勻漿中加入苯酚溶液(苯酚1800ml加水200ml)200ml及01%SDS1000ml，混勻，置60℃水浴振蕩10min，置冰浴冷卻10min，以3500r/min離心30min，取上清液置冰浴中。

2) 精制：在上述上清中加入半量苯酚溶液，室溫下劇烈振蕩10min，以3500r/min離心20min，取水相。加2～3倍體積95%酒精，置冰箱(普通或低溫冰箱均可)過夜。以3500r/min離心30min，棄上清，取沉淀。取少許沉淀，溶于適量水中，測DNA含量及蛋白質，合格后可做下步。

3. 除菌、分裝及凍干

取上述沉淀，加適量三餾水溶解，取少量用紫外分光光度計測RNA含量，按測定結果，將上述溶液用三餾水稀釋至約2mg/ml。加倍量6%右旋糖酐，混勻。用微孔濾膜濾過除菌，分裝(1mg/支)，凍干，封口，待檢。

4. 檢定

1) pH值，取本品2支，溶于10ml餾水中，其pH值應為68～80。

2) 吸收度，取本品溶于餾水中，用紫外分光光度計檢測，其OD260/OD280應不小于20。

3) DNA含量測定，用標準DNA作對照，以紫外法測定，DNA含量不大于5%。

4) RNA含量測定，取本品3支，分別溶解于50ml餾水中，按《中國藥典》二部附錄法測定，三支含量均應在095mg以上。

5) 異常毒性，取本品，以注射用生理鹽水制成05mg/ml溶液，家兔可靜脈注射，應無異常反應。

6) 無菌檢查，取本品3支，溶于6ml無菌水中，分別接種于普通培養基，厭氧培養基及霉菌培養基，培養1周，應無菌生長。

7) 活性測定，采用白細胞粘附抑制試驗。其原理為正常白細胞在體外培養時，可粘附于玻璃表面，而用iRNA處理過的白細胞，其粘附于玻璃表面的能力則被抑制，測知該粘附抑制率，即知iRNA活性。方法為：取綿羊抗凝血，分離白細胞，將白細胞調節為在血細胞計數板上每大格內含40～80個細胞的濃度。取細胞懸液，加等體積iRNA溶液，37℃水浴后，移入血細胞計數板，置37℃溫育后，用鹽水沖洗、計數。同時作正常白細胞(不加iRNA)對照。計算白細胞粘附抑制率，如大于20%為合格。

注意事項

1. 溫度對iRNA活性影響較大。提取過程須加熱時，應嚴格控制溫度及時間。提取間歇時，應置冰浴中。

2. 嚴格控制RNA酶。RNA酶分布廣泛，如污染RNA酶可將iRNA降解而失去活性。因此，各步均應嚴格控制，如器皿泡洗后，應干熱滅菌，操作者應帶手套，提取過程中，可加入RNA酶抑制劑等。

3. RNA的提取主要有熱酚法及冷酚法兩種，前者產率高，但易引起RNA的變性和降解；冷酚法(0～4℃)不易引起RNA的變性和降解，但產率較低。

4. 苯酚為冰狀固體，如顏色變紅，是為氧化之故，應廢棄。苯酚加熱融化后，方可配制，配制時，配制者應注意防護。如苯酚配制后須較長時間存放，應加入8羥基喹啉以抗氧化。