免疫檢測的標準曲線從哪里來？

在臨床免疫學檢測中，常以系列濃度標準品測得劑量反應曲線（即標準曲線），并以此推算待測未知標本的濃度。由于不同的擬合曲線存在不同程度的實測值與理論值的偏差，因此各種檢測項目的標準曲線需要選擇適當的擬合模式，通過選擇不同的函數關系式來改善標準曲線繪制的精密度，從而以較少的數據和計算獲得較為準確的結果^[1]。其常用的函數有插值法和曲線擬合，兩者都是依據已知的離散數據來尋找合適的函數表達式。區別在于，插值得到的函數能夠穿過已知的點，擬合只求函數圖形神似而不求穿過已知點^[2]。下面對兩種函數模式及分類進行簡要的介紹。

1.    插值法（interpolation method）

插值法的前提為假定已知數據是準確的，要求以某種方法描述數據點之間所發生的情況，所以插值是找到一個（或幾個分段光滑的）連續片段來穿過這些點。插值法需完全擬合試驗數據，對數據點的精密度和準確性依賴大^[1]。插值法又可分為線性插值法和樣條插值法。

1.1  線性插值是指將臨近的校準點以點對點的方式用一條直線連接起來。如圖一中的黃色線段。當數據點個數增加和它們之間距離減小時，線性插值就更精確。

1.2  樣條插值法是指將臨近的兩個校準點以一條曲線連起來，對整個標準曲線上各點間的短片段進行數學計算得到一條曲線。換句話說，就是將全部數據分割成若干部分，每個小部分用插值得到不同的函數，最后用很多不同的函數表達原來的序列，所獲得的合成數學函數稱為樣條函數。如圖一中的藍色曲線。

樣條插值法中最常用的方法是三次樣條插值，即將原始長序列分割成若干段構造多個三次函數（每段一個），使得分段的銜接處具有二階導數連續的性質，也就是各點的光滑銜接。當已知測定數據點較多時，其擬合的效果也和實際結果非常吻合。現在有些自動化的分析儀器中，比如某些型號的全自動化學發光分析儀，計算結果就是使用三次樣條插值進行處理的[2,3]。

2.    曲線擬合（curve fitting）

在實際工作中，變量間未必都有線性關系，例如免疫學標準曲線一般均為非線性的，這時就需要選擇適當的曲線類型來擬合已知的觀測數據，并用擬合的曲線方程分析兩變量間的關系。曲線擬合就是將離散的測量數據連續化，找到一個解析表達式的連續曲線來最大限度地逼近這些點。并不要求擬合曲線通過所有數據點，而是要求它反映對象整體的變化趨勢。常見的擬合模式有指數曲線擬合、對數曲線擬合、雙曲線模式、多項式模式、Log-Logit轉換、Logistic公式（兩參數、四參數）等^[3]，其中幾種常見模式的說明如下：

2.1  雙曲線擬合

雙曲線擬合是將測定反應信號對標準品濃度的倒數作圖（ y = a + b(1/x)         ），這種方法對于競爭性免疫測定的數據能擬合出很好的平滑曲線。但在標        準曲線的端值，特別是低濃度端，得不到好的擬合。

2.2 多項式模式

多項式擬合是指將測定反應信號對標準品濃度作圖。三次多項式（y = a + bx + cx2 + dx3）常被用于競爭免疫測定數據的擬合，其形狀像倒狀的‘S’形。當試驗結果剛好在曲線的升段或者降段時擬合效果良好，但是對于區間較廣的情形, 由于其彎曲的波動，三次方程擬合模式不一定很好，且對于一個給定反應值可能會對應兩個結果，因此需要對校正曲線進行截尾。

2.3 Log-Logit轉換

Log-Logit轉換曲線擬合是指將logit（B/B₀）對標準品濃度的對數作圖，經過轉換后，進行最小平方回歸可得到良好的直線。這個模型一般適用于競爭法的擬合，所以擬合時要求至少有一個零濃度測試的OD值，并且此值為整個反應的最大值（也就是我們常說的至少要做一個空白對照）。

2.4  Logistic公式（四參數）

Logistic公式擬合是指將測定反應信號對標準品濃度的對數作圖。所謂四參數擬合，是指用含有四個參數的方程表示因變量y（如吸光度值）隨自變量x（如濃度值）變化的規律，公式為y = (a - d) / [1 + (x/c)^b] +d，其中a為最大反應值，b為斜率，c為拐點濃度，d為本底，R²為曲線擬合度，用來評價曲線擬合效果。結果輸出時要求求出a,b, c, d四個參數使曲線最優，即R²≥0.99。曲線的形狀根據實際情況, 可能是一個單調上升的類似指數、對數或雙曲線的曲線, 也可能是一個單調下降的上述曲線, 還可以是一條S形曲線。四參數擬合回歸不僅限于競爭法, 實際上夾心法也可使用。在很多情況下它都可以擬合ELISA的反應曲線, 所以它也成了ELISA中應用最廣的模型之一^[4]。

在實際應用中選擇擬合函數時，除了按照競爭免疫測定和非競爭免疫測定等粗略篩選外，還可以先根據數據做出散點圖，然后按照散點圖的走勢，直觀判斷確定擬合函數；也可以通過軟件（如CurveExpert，GraphPad等），自動做出所有擬合函數下的標準曲線，再根據R²值進行選擇。在化學發光免疫分析中，以各擬合模式反求標準品濃度，與其真值比較即可判斷擬合模式是否合理。例如有實驗室研究結果表明，應用四參數模式擬合甲狀腺素化學發光法測定的標準曲線其實測值與真值相差最小^[5]，而以樣條函數擬合胰島素的標準曲線測得的濃度更接近真值^[2]。因此免疫分析的標準曲線應進行擬合模式的選擇，以便找出與標準品真值最接近的模式，獲得最可靠的測定結果。

參考文獻

1.    肖友益, 楊厚清, 白忠華. 巧用放免儀擬合標準曲線[J]. 現代檢驗醫學雜志, 2003, 18(5):30-30.

2.    肖友益. 化學發光免疫分析標準曲線擬合模式選擇[J]. 現代檢驗醫學雜志, 2009, 24(5):157-157.

3.    胡黎婭, 張強. 腫瘤標志物CA242標準曲線的擬合[J]. 現代檢驗醫學雜志, 2001, 16(3):32-32.

4.    楊利國. 酶免疫測定技術[M]. 南京大學出版社, 1998.

5.    駱春艷. 不同標準曲線擬合模式對化學發光免疫分析測定結果的影響[J]. 世界最新醫學信息文摘:電子版, 2013(5):40-40.