免疫沉淀實驗

蛋白質

裂解緩沖液 稀釋緩沖液 SDS Tris TSA

轉子 離心機

1.  表面標記或生物合成標記的細胞在裂解緩沖液中于4℃放置1 h 后，再于4℃3 000 g 離心10 min 除去細胞核，然后將所得上清在10000 g 離心1 min。

2.  一次性對上清進行預處理，每200 μl 上清加入10 μl 活化后被淬滅的瓊脂糖對照。在旋轉揺床中室溫揺蕩2 h 或在4℃過夜。200 g 離心1 min，保留上清。

3.  在1.5 ml 的微量離心管中加滿裂解液室溫作用10 min，對其進行預包被。吸去液體后，加入10⁵~10⁶ cpm 的含抗原的放射性標記上清，加稀釋緩沖液使終體積為200 μl。

4.  加入10 μl 1：1的抗體-Sepharose偶聯物膠漿/稀釋緩沖液。4℃在旋轉搖床中搖蕩1. 5~3 h，一直保持Sepharose呈混懸狀。

5.  Sepharose偶聯物依次用1 ml 下面列出的緩沖液洗滌。毎次洗完后，200 g 離心5 min 或微量離心5 s。以細頭的巴斯德吸管小心吸去上清，僅在沉淀的上面留10 μl 的液體。在第4次洗滌后，離心甩下管壁所有殘余液滴并將其吸去，沉淀上僅留下約 10 μl。

6.   加入20~50 μl SDS樣品緩沖液。由于樣品緩沖液比重大于洗滌緩沖液，它可滲透到Sepharose中，不要用旋渦混合器旋起SEpharose，以免使之粘附在緩沖液液面以上的管壁。蓋緊蓋子，于100℃保溫5 min。

7.  用旋渦混合器混勻，200 g 離心或微量離心5 s。將上清加樣于凝膠以SDS-PAGE分析，使用增感屏進行放射自顯影或熒光自顯影或檢測標記蛋白質。

圖一、用于分離蛋白質的抗原的免疫沉淀