免疫沉淀

免疫沉淀是利用特異性抗體識別并分離抗原的方法。

材料：

上樣buffer的配方(用前現配):

2ul        1.25M Tris-HCL , pH 6.8

35ul       distilled water

2.5ul       2-mercaptoethanol

12.5ul      10%SDS

10ul       80% glycerol

2ul        bromphenol blue

TNE buffer:

10mM Tris-HCl pH 8.0

10mM NaCl

0.5mM EDTA

方法：

1．用含有1% NP40的緩沖液重懸細胞，充分振蕩。

2．在冰上孵育30分鐘或37℃孵育10—15分鐘

3．轉入eppendorf管中離心3分鐘

4．將上清輕輕倒入一干凈試管，加入40—50 ul抗血清

5．冰上孵育2小時或4℃過夜

6．在TNE中加入100ul SPA 和100ul 5% BSA

7．冰上孵育2小時

8．離心使免疫復合物成球，用1ml含1%NP40,0.5% Na deoxychloate, 0.1% SDS 的TNE,在用超聲波重懸

9．加入70ul的上樣緩沖液，振蕩。

10．熱水中水浴90秒，離心1分鐘，保留上清。

11．若不立即實驗請低溫保存。

（以上資料僅供參考）

免疫細胞化學：

1．在無菌消毒的6孔板中加入100，000個/孔細胞，過夜

2．倒掉上清，用PBS洗滌一次后立即加入-20°C的甲醇（注意不要讓細胞干掉），再將板置于-20°C冰箱5分鐘，然后倒掉甲醇加入PHEM 緩沖液，置于4°C。

3．加入含合適血清（2.5—5%）的PHEM 緩沖液輕微振搖一小時

4．加入一抗至封板緩沖液，輕微振搖孵育一小時

5．倒掉封板液，加入PHEM 緩沖液洗滌4次，每次10分鐘

6．加入二抗至封板緩沖液，輕微振搖孵育半小時

7．倒掉封板液，加入PHEM 緩沖液洗滌4次，每次10分鐘

8．用鑷子夾起 coverslip，輕輕去除過多的緩沖液，加入約20ul“antifade”, 輕輕蓋上coverslip, 去掉過多的”antifade” 后置于-20°C避光保存。

試劑配方：

PHEM 緩沖液：:

25 mM HEPES

10 mM EGTA

60 mM PIPES

2 mM MgCl₂

pH = 6.9

（請以此順序加入）

Antifade: 1 ml

1 mg p-phenylene diamine hydrochloride 溶解在 0.1 ml 10x PBS (20 min 室溫)

加入 0.9 ml 100% 甘油，封閉保存不要振搖。

若顏色變成棕色，請不要用了。分裝保存在-70 °C