免疫球蛋白標記技術

抗體

戊二醛液 萘氏試劑 PBS NaIO4 碳酸鹽緩沖液 醋酸鈉緩沖液 NaBH4

攪拌器 分光光度計 離心機 透析袋 燒杯 試管 吸管

一、酶制劑及其底物

凡無毒性又能呈現有色化學反應的酶，原則上均可作為標記用。但作為標記抗體用的酶應滿足下列要求

1.  來源方便，易于純化；

2.  比活性高，性質穩定；

3.  酶活性和量能用簡單方法測定。

目前在免疫酶技術中常用的酶為辣根過氧化物酶（HRP）和鹼性磷酸酶（AP），其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。

　　
由于辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase， HRP）比活性高，穩定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18 ％。HRP由多個同功酶組成，分子量為40000，等電點為PH3～9，酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58 ％以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403 nm和275 nm，一般以OD403 nm /OD275 nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的純度。高純度的酶RZ值應在3.0左右（最高可達3.4）。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活性，如當酶變性后，RZ值仍可不變。

　　
HRP的催化反應需要底物過氧化氫（H₂O₂）和供氫體（DH₂）。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應可生成有色的氧化型染料（D）。酶促反應的過程如下
 

　　　　　　　　　　　　　　　HRP

　　　　　　　　　DH₂＋H₂O₂────→D＋2H₂O

　　
供氫體的種類很多，形成的產物特點不一。如DAB（3，3－二氨基聯苯胺）的反應產物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。5AS（5-氨基水楊酸）早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現已很少應用。OT（鄰聯甲苯胺）的特點是能產生鮮艷的藍綠色產物且靈敏度較高，但反應中受溫度影響較大，而且由于產物不穩定，需要在短時間內進行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD（鄰苯二胺）和TMB（四甲基聯苯胺）。前者形成的產物為深桔黃色或棕色，后者產物為藍綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩定，空白可近于無色，靈敏度上據報道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS[2，2'-邊氮基-雙（3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸）]，其反應產物呈藍綠色，且靈敏度和穩定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優選的供氫體。

　　
由于HRP的底物H₂O₂本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應中使用的H₂O₂不能過量。應控制在經較短時間反應后呈色即達高峰（說明H₂O₂已消耗殆盡）。這樣即使再延長時間也不會增加反應產物的顏色。

二、HRP標記抗體的方法

酶與抗體交聯的方法有許多種，根據酶的結構不同可采用不同的方法。對于制備HRP結合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用。

　　
1.  戊二醛二步法
 

（1）原理

戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。
 

（2）標記步驟
 

①稱取HRP25 mg溶于1.25 ％戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。

 
②反應后的酶溶液經Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1 ml/1 分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5 ml，則以PEG濃縮至5 ml。放置25 ml小燒杯中，緩慢攪拌。

③將待標記的抗體12.5 mg用生理鹽水稀釋至5 ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。

④用1 M PH9.5碳酸緩沖液0.25 ml，繼續攪拌3 小時。

⑤加0.2 M賴氨酸0.25 ml，混勻后，置室溫2 小時。

⑥在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4 ℃1 小時。

⑦3000 rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15 M PH7.4的PBS中。

⑧將上述溶液裝入透析袋中，對0.15 M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后（用萘氏試劑檢測），10000 rpm離心30 分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保存。

（3）結果判定
 

①定性及效價滴定

用特異性抗原（或抗體）同酶標記抗體（或抗免疫球蛋白抗體）作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA法（或在正式實驗系統里）對酶結合物進行滴定。
 

②定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定（光程1 cm）。
 

酶量（mg/ml）＝OD403 nm×0.4
 

IgG量（mg/ml）＝OD280 nm-OD403 nm×0.42×0.94×0.62
 

　　　　　   酶量（mg/ml） IgG量（mg/ml） 酶量

克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4

　　　　　　　40000 　　　160000　　　IgG量
 

③本法標記步驟比較簡單，重復性好。缺點是酶的利用率低，一般只有2～4 ％的酶與蛋白質結合。
 

2.  簡易過碘酸鈉法

　　
本法是以NaIO₄先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結合，所獲酶標記抗體的產率高，將近70 ％的HRP和Ig結合，99 ％的Ig與酶結合，酶與Ig的活性無重大損失，是目前最常用的方法。

（1）原理

經典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO₄氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經NaIO₄氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進一步用NaBH_4（或乙醇胺）還原生成穩定的酶標記抗體。

　　
（2）標記步驟
 

①稱取5 mgHRP溶解于1 ml蒸餾水中。

　　
②于上液中加入0.2 ml新配的0.1 M NaIO₄溶液，室溫下避光攪拌20 分鐘。

　　
③將上述溶液裝入透析袋中，對1 mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4 ℃過夜。

　　
④加20 μl 0.2 M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10 mg IgG（抗體，或SPA5 mg）在1 ml 0.01 M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2 小時。

　　
⑤加0.1 ml新配的4 mg/ml NaBH₄液，混勻，再置4 ℃ 2 小時。

　　
⑥將上述液裝入透析袋中，對0.15 M PH7.4 PBS透析，4 ℃過夜。

其余步驟（純化）同戊二醛標記步驟的⑥、⑦、⑧。

　　
（3）結果判定
 

除標記物IgG量的計算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。

IgG量（mg/ml）＝（OD280 nm-OD403 nm×0.3）×0.62

1.  在具備高質量HRP的條件下，所要標記的抗體也要活性高，效價高（最低1∶16），純度高，親和力好，這是保證標記物效價高，免疫活性好的首要條件。

2.  所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑，最好（或必需）新鮮配制。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應為新鮮純品，因戊二醛儲存過久可形成縮和體（雜質）。否則，影響標記效果。

3.  室溫攪拌時須避光，室內溫度一般在25 ℃為宜。標記物每次透析前，須認真檢查，防止漏液。

4.  濃的標記物相當穩定，常加入30～40 ％甘油于-10 ℃下保存。4 ℃可保存1～2 年，但稀釋成1∶10，只能保存數周。已配制的使用液應在12 小時內用完。切忌反復凍融。

一、工作濃度的選擇

　　
在免疫酶技術中，首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化，便可導致試驗結果產生很大的波動。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。

　
1.  酶標記抗體的滴定方法

將抗原（或抗體）物理吸附于固相載體上，然后將經過一系列稀釋的酶標抗體（或抗Ig抗體）與吸附在載體上的抗原（或抗體）起反應，以酶與底物的顯色反應程度來確定酶標記抗體的效價，或稱工作濃度。

　　
2.  步驟

先將抗原（或抗體）用0.05 M PH9.6包被緩沖液稀釋為10 μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔內加0.1 ml，4 ℃過夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1 ％BSA-PBS液依次稀釋成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600......（根據據抗體的滴度而定），分別加入反應孔中，每個稀釋度二孔，每孔0.1 ml，37 ℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液，每孔0.1 ml，37 ℃10～30 分鐘。以2 M H₂SO₄ 0.05 ml終止反應。

3.  結果判定

主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值。并以OD為縱座標，結合物濃度為橫座標，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率最大時的酶標抗體稀釋度，即為該標記物的工作濃度。

4.  有關試驗的試劑及器材均見ELISA部分。

5.  要說明的是，本法為ELISA直接法，所測的工作濃度與在實際應用中的最適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA實驗系統中，因此基礎上還應進一步確定實際工作濃度（可采用方陣法），以達到最適的實驗條件。