實驗方法原理 免疫電泳試驗是凝膠電泳與雙向免疫擴散相結合的免疫化學技術。應用瓊脂進行免疫電泳試驗可分為以下二個步驟:
瓊脂電泳 將待檢的可溶性物質在瓊脂板上進行電泳分離,由于各種可溶性蛋白分子的顆粒大小、質量與所帶電荷不同,在電場的作用下,其帶電分子的運動速度(遷移率)具有一定規律,因此通過電泳能夠把混合物中的各種不同成分分離開來。以血清為例(圖4-12A),電泳后各種成分的位置是電泳速度與電滲速度的代數和。白蛋白分子量較小,所帶負電荷較強,泳動最快,依次為α1、α2及β球蛋白,γ球蛋白泳動最慢。
2.瓊脂擴散 當電泳完畢后,在瓊脂板一端挖一條長的槽,加入相應抗血清,置濕盒內讓其進行雙向擴散。在瓊脂板中抗原和抗體互相擴散,當兩者相遇且比例適合時,可形成不溶性抗原抗體復合物,出現乳白色的特異性沉淀弧線(圖4-12B、C)。
實驗材料 待檢血清
試劑、試劑盒 巴比妥緩沖液人IgG兔抗人血清抗體
儀器、耗材 瓊脂載玻片打孔器電泳儀電泳槽萬用電表
實驗步驟
1. 瓊脂板的制備 將潔凈之載玻片置于水平臺面上,用吸管吸取 4ml1.2%熱溶的瓊脂于載玻片上,待凝固后按圖4-13打孔及開槽。
2. 加樣 挑去孔中瓊脂,用微量加樣器于上孔加待檢血清15μl,下孔加IgG溶液(lmg/ml)15μl。
3. 電泳 置電泳槽中,用三層紗布作電橋,將近孔的一端連接陰極,另一端接陽極,以端電壓6V/cm電泳1~2h。
4. 擴散 電泳后挑去長槽內瓊脂,用熱溶的1.2%瓊脂封底。然后于槽中加入兔抗人血清抗體,置濕盒內,于37℃溫箱中擴散24h,連續觀察結果,至沉淀弧線完全清晰為止。
注意事項
1. 操作時動作要迅速小心,挖槽時要注意平行整齊,加入抗體不要外溢。
2. 抗原抗體比例要適合。
3.對分子量過小的抗原(如游離Ig輕鏈)要隨時觀察結果。
4. 有時抗原抗體反應形成的沉淀線很弱,肉眼不易觀察,可以染色。
其他
觀察并描記沉淀弧的數目、位置及形狀,參照免疫球蛋白遷移范圍示意圖(圖4-14),識別主要Ig。