（4）膠體金與蛋白A的結合和純化，依上法測得所需的比例超過10%，即每30ml膠體中加入2mg蛋白A，5min后，加入0.3ml
PEG作為穩定劑，然后以15000r/min離心45min（不同方法制備的金離心速度不同），略帶紅色的松散的復合物沉淀即為PAg復合物。小心棄去上清液，加入PBS沖洗，如上，松散的PAg復合物置于PBS溶液中，按0.2mg/ml的比例加入聚乙二醇作為穩定劑，保存于硅化的玻璃器皿中備用，也有主張將上述PAg復合物放入3～6ml
5%甘油—0.05%聚乙二醇—0.02%疊氮鈉混合液中，再離心，棄去無色上清液后，收取管底部濃縮純化的PAg復合物置4℃保存。
據文獻報告，此PAg復合物的原液在4℃可保存達一年之久。
2、電鏡水平的PAg染色法 PAg法在電鏡技術的應用原則是二步標記法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要區別于一般膠體金免疫染色在：①須1%
卵白蛋白—PBs （pH7.4）或1%卵白蛋白—0.05mol/l
Tris緩沖液（pH7.4）來封閉非特異性的結合部位，而不是采用羊或其它的動物的正常抗血清，因為PAg復合物能夠與正常血清組中的Ig結合，從而給出假陽性結果；②在應用第一抗血清孵育和PBS沖洗后作第二抗血清即PAg復合物孵育前的準備時，應用的PBS或TBS的pH應變更為pH7.4.在變更這兩步后，其它可參照本節
中包埋前、后染色法進行。也可采用下列步驟進行包埋后染色。
（1）載有超薄片的鎳網或金網浮于1%卵白蛋白—PBS液滴上，室溫約5min.
（2）載網不沖洗，直接移至第一抗血清液滴上，在室溫孵育2h或4℃18～24h.
（3）PBS沖洗3min×2次。
（4）將PAg原液稀釋10～20倍，載網浮于該液滴上，室溫孵育1h.
（5）PBS沖洗5min×2次。
（6）5%醋酸鈾水溶液染色，水洗。
（7）枸椽柄鉛染色。
（8）電鏡觀察。
三、膠體金雙標記技術（常用為蛋白A—膠體金）
1、單面法以不同直徑的金粒分別標記兩種不同的抗體，以間接法先染第一種抗體，洗凈后再染第二抗體。
2、雙面法以不同直徑的金粒標記的抗體于鎳網的兩面分另進行免疫染色。本法的優點是可防止兩種金標記的抗體的相互干擾，又可防止第一次應用的一抗與其相應的抗原相結合，占據了空間，第二次應用的抗體沒有適合的空間使之與相應的抗原相結合。
3、異種動物抗原—抗體染色法如一抗分別用人與兔抗血清，人抗組織抗原A，兔抗組織抗原B.第二抗體分別以不同直徑金粒標記的抗人和兔免疫球蛋白。由于種屬不同，兩種抗血清不會互相干擾，在應用一抗和二抗時都可將兩種血清一次混合使用，將四步減少為兩步。
4、金標記抗原檢查法（Gold—labelled antigen detection method, GLAD 法）此法是
Larson（1977）年首先提出的，應用放射性同位素如125I或酶標記抗原進行染色。先用特異性抗體與組織抗原反應，標記的純抗原又與特異性抗體反應。Larson（1980，1981）又在此基礎上提出應用膠體金在電鏡水平進行雙抗原甚至多抗原定位。GLAD原理是：雙價的Ig抗體分子過量地加到有抗原的組織切片上，使分子的兩個抗原結合點中有一個結合到組織抗原上，而另一端可與標記金的抗原起反應。雙標記時，預先將兩種不同的抗原標以不同直徑的金粒，可分別與相應的第一抗體相結合，從而顯示出兩種抗原在組織切片的定位。此法的優點是標記物所顯示出的組織抗原的部位經過兩次選擇，標記了抗原只能與相應的特異性抗體相結合而不能與切片中非特異性Ig相結合，因此具有較高的特異性。但由于使用此法時需備有與欲檢抗原相同的純抗原，并要對不同抗原分別進行標記，非一般實驗室所能做到，所以至今尚未被廣泛應用。
雙面金標記法操作程序（Cai et al 1993, 改良自Bendayan et al 1982）。
（1）鎳網面A（樹脂包埋）
①蒸餾水沖10min.
②10% H2O2蝕刻10min室溫
③10%正常血清（以0.5mol/l Tris緩沖液pH7.4、含1%BSA和2%Tween20 稀釋，簡稱TBT緩沖液）室溫30min.
④以濾紙吸去多余液體，覆于特異性第一抗體1：500（Tris 緩沖液，pH7.4,含1%BSA和0.1%疊氮鈉）4℃，孵育過夜
⑤徹底清洗，應用0.5mol/L Tris緩沖液pH7.2,不含BSA
⑥繼之用0、5mol/L Tris緩沖液pH7.6,含1%BSA沖洗
⑦0、5mol/L Tris緩沖液pH8.2,含1%BSA，室溫孵15min
⑧羊抗兔IgG標記以15nm金粒，應用0.5mol/l Tris緩沖液pH8.2、含1%BSA稀釋1：40，孵育2h，室溫
⑨0、5mol/L Tris緩沖液pH7.4 沖洗
⑩蒸餾水沖洗
（2）鎳網面B，重復①～⑩，只在第④時更改另一特異性一抗，在⑧時羊抗兔IgG標記以5nm金粒。
（3）鈾鉛雙重染色，電鏡觀察，可見二種不同直徑金粒標記。
注意事項：①所有溶液均須經加有微孔濾紙（0.45μm孔，國內外現均有商品提供）的注射器過濾，過濾后直接以注射器沖洗。②濾紙最好用無纖維吸水濾紙。③沖洗在膠金標記技術上是個決定性關鍵，僅次于抗體血清的純度。筆者的體會是一般應漂洗3×5min，以注射器噴水漂洗效果優于杯漂洗法，但漂洗水流需與網面平行，勿使水壓破壞切片。
四、免疫電鏡金—銀法染色技術
關于免疫金銀細胞化學的原理、試劑配制和光鏡顯示技術在本書第五章 已作了較詳盡的敘述。免疫金銀細胞化學技術說可應用于電鏡水平。一般用于包埋前染色。其主要操作步驟如下：
（1）組織固定振動切片機切片10～30μm.
（2）人3%正常羊血清，含0.1%Triton X—100 的PBS孵育30min，以封閉非特異性結合部位
（3）1%硼氫化鈉的PBS孵育30min.
（4）一抗37℃，2h.
（5）PBS含0.1%BSA pH7.4 沖洗3min×3次。
（6）PBS含0.1%BSA pH8.2 沖洗3min×3次。
（7）人10～15nm金標羊抗兔抗血清，工作濃度約1：10，37℃孵育45min.
（8）硝酸銀液物理顯影（詳見第五章 第六節 ）。
（9）在解剖顯微鏡下取免疫反應陽性部位，人1%鋨酸后固定20min，常規脫水，樹脂包埋。
（10）超薄切片機切0.1μm左右半薄切片，定位陽性反應部位，制超薄切片。如有暗視野微鏡則更有助于定位。在暗視野前景下，金銀粒呈金黃色閃光顆粒，即使微量金銀也可定位，微鏡則更有助于定位。在暗視野前景下，金銀粒呈金黃色閃光顆粒，即使微量金銀也可定位。
（11）鈾—鉛電鏡染色，電鏡觀察。
免疫金銀法敏感度高，金銀顆粒電子密度高，反差強；應用包埋前染色可先定位陽性反應部位再作電鏡超薄切片，獲得陽性反應機率高，特別適用于含微量抗原的部位，如突觸等。其不足是須經暗室顯影，手續較煩雜，包埋前免疫染色易增加非特異性染色。另外，由于單個金粒周圍結合的銀粒不是固定的，受多種因素影響。因此，電鏡免疫金粒染色法的金粒銀粒計算不適于做半定量觀察，誤差較大。