免疫組化實驗原理和步驟（一）

實驗原理：

抗體和抗原之間的結合具有高度的特異性，免疫組織化學正是利用了這一原理。先將組織或細胞中的某種化學物質提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細胞中的同類的抗原物質。由于抗原與抗體的復合物是無色的，因此還必須借助于組織化學的方法將抗原抗體結合的部位顯示出來，以其達到對組織或細胞中的未知抗原進行定性，定位或定量的研究。

實驗材料：

（一）儀器設備

18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐、水浴鍋

（二）試劑

1、PBS緩沖液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L、KCl 2.7mmol/L 、Na2HPO4 4.3mmol/L、KH2PO4 1.4mmol/L。

2、0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液（CB,ph6.0,1000ml）：檸檬酸三鈉3g、檸檬酸0.4g。3、0.5mol/L EDTA緩沖液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226；2H2O，用10mmol/L NaOH調至ph8.0，加水至1000ml。

4、1mol/L的TBS緩沖液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調至ph8.0, 加水1000ml。

5、 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6、3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

7、風裱劑：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（ph9.0–9.5）等量混合b 油和TBS(PBS)配制

8、TBS/PBS PH9.0–9.5，適用于熒光纖維鏡標本；ph7.0-7.4適合光學纖維標本。

實驗步驟：

（一）脫蠟和水化：

脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。

1、 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘。

2、無水乙醇中浸泡五分鐘。

3、 95%乙醇中浸泡五分鐘。

4、75%乙醇中浸泡五分鐘。

（二）抗原修復：

用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片：

1、抗原熱修復

（1）高壓熱修復在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m檸檬酸鈉緩沖溶液（ph6.0）。蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色加上，緩慢加壓，是玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。

（2）沸熱修復電爐或水浴鍋加熱0.01檸檬酸鈉緩沖液（ph6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。

（3）微波爐加熱在微波爐里加熱0.01檸檬酸鈉緩沖液（ph6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5-10分鐘，反復1-2次。適用的抗原Bcl-2、ax、AR、PR、C-fos、x-jum、z-kit、c-myc、E-cadherin。ChromograninA、Cyclin、ER、Heatshock、Protein、HPV、Ki-67、MDMZ、P53、P34、P15、P-glycoprotein、PKC、PCNA、ras、Rb等

2、酶消化方法

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱37℃，消化時間約為5-30分鐘。適用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen、GFAP、Complement、Cytokeratin、C-erB-2、LCA、LN等。

（三）免疫組化染色SP法

1、脫蠟、水化。

2、PBS洗2-3次各5分鐘。

3、3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘。

4、PBS洗2-3次各5分鐘。

5、抗原修復。

6、PBS洗2-3次各5分鐘。

7、滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體。

8、滴加Ι抗50μl,室溫靜置1小時或4℃過夜或37℃1小時。

9、4℃過夜后需在37℃復溫45分鐘。

10、PBS洗3次每次2分鐘。

11、滴加Ⅱ抗45-50μl,室溫靜置或37℃1小時。

12、Ⅱ抗中可加入0.05%的tween-20。

13、PBS洗3次各5分鐘。

14、DAB顯色5-10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度。

15、PBS或自來水沖洗10分鐘。

16、蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化。

17、自來水沖洗10-15分鐘。

18、脫水、透明、封片、鏡檢。

（四）SABC法

1、脫蠟、水化 。

2、PBS洗2次各5分鐘。

3、用蒸餾水或PBS配制新鮮的3%H2O2，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗3次（4）抗原修復。

4、PBS洗5分鐘。

5、滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體。

5、滴加Ι抗50μl,室溫靜置1小時或4℃過夜或37℃1小時。

6、PBS洗3次各2分鐘。

7、滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分鐘。

8、PBS洗3次各2分鐘。

9、滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘。

10、PBS洗4次各5分鐘。

11、DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色。

12、脫水、透明、封片、鏡檢。