免疫組化沒有任何著色的解決辦法

DAB是否有效，可通過DAB直接與二抗反應，若不顯色，則是DAB有問題或是二抗有問題， 是否DAB失效或是二抗濃度太低，可更換DAB或提高二抗濃度。排除這兩者原因，再摸索最佳條件。

首先要弄明白，所謂的DAB染色是怎樣來的，DAB和過氧化氫是HRP的底物，可以說有三個環節

1：DAB是否在有效期，和是否被稀釋，后者就要求片子要擦干，甩干，這樣才能保證DAB的有效濃度。

2：如果不是用DAB試劑盒，一定要注意要加過氧化氫，并保證其濃度

3：要保證HRP的存在和足夠，這就需要你一抗有效和組織要有抗原表達，二抗和三抗要有最適的濃度

建議你找一張標準的片子看一下，可能目前你還不清楚你自己要染什么，你要染的是你的組織中分布的抗原，不是背景，如果你要求的抗原都未染出，還要求背景做啥？

免疫組織的特異性染色指抗體只與相應的靶抗原決定簇反應，與其他抗原決定簇不起反應，組織切片內只有含靶抗原的部位染色才陽性。理想的免疫組織染色只有特異性反應的染色，陽性產物反應強，背景清晰。因而兩者能形成鮮明對比。凡不屬于上述特異性反應的染色，通常稱為非特異性或背景著色。

免疫組化的實質就是酶促反應，DAB和過氧化氫是HRP的底物，你要保證此反應，你就要注意三個環節，就想上面我回復的那一貼一樣，你一個個篩選去找你自己存在的問題。因為像你這種情況，可能的原因很多。

無色片

染色結束后，切片中見不到任何陽性信號。這是常規工作中比較常見的現象，出現這種現象，有兩種可能：

1、真陰性結果：整個染色過程沒有出現問題，組織或細胞確實不表達與抗體相關的抗原。

2、假陰性結果：即此陰性結果不是真實的反映。

假陰性結果又可分為兩種情況：

（1）、切片中根本就不包含所預期檢查的組織或細胞。出現這種情況，要麼是病理醫生選擇錯了切片或抗體選錯了，要麼是技術員選錯了蠟塊。獲得正確的切片進行染色是獲得正確結果的前提。由此表明：制作出合格的免疫組化切片不僅僅是技術員的事，病理醫生也起著不可缺少的作用。

（2）、染色過程中的某一或某些環節出了問題。比如，組織未進行抗原修復，有的組織必須經過抗原修復才能檢測抗原表達；

或選用了只能用于冰凍組織而不能用于石蠟包埋組織的抗體；

或一抗失效，雖然抗體失效在理論上是一個逐漸的過程，但偶爾也遇到突然失效的情況，抗體長期不用和/或已超過有效期是主要的原因。也可見于染色過程中漏掉了某一環節，如忘記加二抗或三抗，或用了兩次二抗而缺少了三抗，或配制DAB時少了過氧化氫。

為了避免這種簡單的錯誤，有一種簡單的方法：在三抗孵育結束時，將切片上的三抗甩在一張白紙上，在將配制好的DAB滴一滴在白紙的三抗上，觀察是否出現棕色。如果出現了，證明三抗和DAB的配制過程沒有錯誤。

如果這種DAB再滴到切片上沒有出現任何陽性信號，問題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現棕色反應，問題肯定在三抗或DAB或DAB的配制過程。這種簡單方法能迅速的幫助我們查找出現問題可能的原因。

解決陰性染色的問題非常簡單，就是設立“陽性對照”。如果陽性對照有了表達，說明染色的全過程和所有試劑都沒有問題。如果此時測試片仍為陰性，便是真實的陰性，說明組織或細胞沒有相應的抗原表達。

反之，如果陽性對照沒有著色，表明染色過程中某個或某些步驟出了問題或試劑出了問題。應一一尋找原因。陽性對照包括兩種，一種稱為“自身對照”或“內部對照”，這是指在測試的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴結中存在T和B細胞抗原，CD20或CD3都應該有表達。

自身對照是一種比較理想的對照，對照和測試組織或細胞都在同一張切片中，都處于相同的試驗條件下，結果更可靠也更具有可比性。在選擇自身對照片時最好選擇既有病變組織同時又有正常組織的部分，這樣有利于對比。

另一種稱為“外部對照”，有時在測試的切片中不存在已知的抗原，如在胃的標本中懷疑是惡性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1來檢測，在正常的胃組織中本身不存在相關的抗原，如果病變出現陽性反應結果，尚能提示是惡黑，但是如果出現陰性結果，就無法確定是本身組織中不含黑色素瘤抗原，還是技術問題。

因此，應另外設立一個已知的陽性對照。這種在測試組織之外的陽性對照稱為“外部對照”。在實際工作中需要設立外部對照的情況很多，如果每一種抗體都要選不同的陽性對照，工作量會很大。

為了解決這個問題，目前國內外有單位將多種不同組織集成在一起，制成多組織切片、“臘腸”“春卷”切片、組織芯片等，其連續切片儲備待用，需要時取出一張便可作為陽性對照。

另外，比較簡單的方法，是采用闌尾作為陽性對照，因為與人體其它組織器官比較闌尾包含的組織種類較多，如有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質、神經、血管、間皮等。一張闌尾切片可以檢測大多數常用的抗體。

設立陽性對照是病理醫生的任務或責任，而不是技術員的責任。病理醫生觀察了HE切片，了解切片中是否有自身對照，如果沒有，就應告訴技術員采用陽性對照。因此，病理醫生在免疫組化中的作用是不可忽視的。

抗體未覆蓋上測試組織：當多塊散開的小組織染色時，可能漏掉某塊組織染色。

我做免疫組化時也碰到過完全沒有著色的情況，多為抗原未修復或一抗的問題，所以應該特別注意。

首先，你確定整個片子呈黃色不是正常的，角膜厚度要注意，再者我還想說一點一抗即用型，這種東西我不是很放心，你試試把一抗濃度稀釋下，不要完全迷信一抗即用型，因為組織不同，一抗濃度也不可能一樣，很多情況都是抗體濃度沒掌握好。

我自己曾經按照說明書的推薦濃度（1：50~1：150）上下2個數量極摸索，我一直到1：1000才做出最好的效果，經歷是慘痛的，呵呵~~ 抗體孵育時間，我個人感覺不是做不做得出來的問題，而是效果好壞的問題，有的資料說4度過夜，不僅結合的牢固，而且非特異染色少。

我想這可能和某些抗原有關吧，但是你可以37度1~2個小時試試看，要有早就有了，不要浪費時間試4度的，我到是懷疑你組織抗原表達問題（因為你的冰凍切片好像有，老大，何謂好像有？），會不會你的標本模型沒做好？或者固定時間過長？固定方式不合理？

DAB顯示看你是什么試劑盒，不同試劑盒的時間要求有所不同；不同組織染色時間也不同。

免疫組化最重要的是預實驗摸條件的時候。需要摸索的條件包括：一抗濃度和孵育時間，反應過程中某些細節時間或要求（如過氧化物封閉時間、熱抗原修復次數等—）、DAB顯色時間。

滴上DAB之后，應該馬上在鏡下觀察顯色情況。判斷標準是：最好有標準的圖片（文獻或試劑說明），根據標準和你染的組織進行判斷。陽性的結果不是一片黃染，你應該是過染了，原因或者是一抗濃度高了，或者DAB顯色時間太長了。

我不清楚的是為什么你在鏡下看是一片黃色，封片后變成透明。

建議：開始的時候用一兩張切好的片摸條件，這種片是自己預計中陽性率可能性比較大的切片。