免疫組化

一，免疫組織化學簡介

免疫組織化學又稱免疫細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應炕原進行定性、定位、定量測定的一項新技術。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。

二，免疫組化技術的基本原理

免疫組化技術是一種綜合定性、定位和定量；形態、機能和代謝密切結合為一體的研究和檢測技術。在原位檢測出病原的同時，還能觀察到組織病變與該病原的關系，確認受染細胞類型，從而有助于了解疾病的發病機理和病理過程。

免疫酶組化技術是通過共價鍵將酶連接在抗體上，制成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，于普通顯微鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成分的定位，根據酶標記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯法（多步法）等，用于標記的抗體可以是用免疫動物制備的多克隆抗體或特異性單克隆抗體，最好是特異性強的高效價的單克隆抗體。直接法是將酶直接標記在第一抗體上，間接法是將酶標記在第二抗體上，檢測組織細胞內的特定抗原物質。目前通常選用免疫酶組化間接染色法。

三，免疫組化步驟

1，切片，烤片60℃，1h；

2，脫蠟及復水

二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自來水1min，雙氧水1min；

3，1份30％H2O2加10份蒸餾水，室溫10min，蒸餾水洗3次，每次3min；

4，微波修復

將切片浸入0.01M枸櫞酸緩沖液，微波中最大火力（98℃-100℃）加熱至沸騰，冷卻（約5-10min），反復兩次；

5，將切片自然冷卻至室溫，PBS洗滌3次，每次5min；

6，封閉，5％BSA，室溫20min，甩去多余液體；

7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃過夜；

8，PBS洗滌3次，每次3min；

9，滴加二抗，37℃，15-30min；

10，PBS洗滌3次，每次3min；

11，滴加SABC，37℃， 30min；

12，PBS洗滌3次，每次5min；

13，1ml蒸餾水中分別滴加顯色劑，混勻；

14，DAB顯色劑配置好后，滴加于切片，室溫，鏡下檢測反應時間（約5min）；

15，自來水沖洗干凈，過蒸餾水；

16，蘇木素復染2min，自來水沖洗；

17，脫水

30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；

18，樹膠封片，鏡檢。

四，免疫組化常見問題分析

1，石蠟切片在染色過程中出現脫片現象

1）烤片時間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時間和提高烤片溫度；

2）用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購買到或這自己做；

3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織；

4）用高溫修復時，溫度驟冷也可能引起。

2，邊緣效應

1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致. 解決辦法：制備優質的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應規范，盡量避免選用壞死較多的組織；

2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時，為了避免油劑的影響，畫圈應距組織邊緣3-4mm。

3，產生組織切片非特異性染色

1）抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條；

2）一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；

3）內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

4）非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；

5）DAB孵育時間過長或濃度過高；

6）PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；

7）標本染色過程中經常出現干片，這容易增強非特異性著色。

4，免疫組化染色呈陰性結果

1）抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤；

2）抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結合；建議微波修復用高火4次*6min試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數。若不行，還可高壓修復；

3）組織切片本身這種抗原含量低；

4）血清封閉時間過長；

5）DAB孵育時間過短；

6）細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內參與反應；

7）開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。

5，背景

1，考慮一抗濃度高；

2，然后調整DAB孵育時間；

3，也要考慮血清封閉時間是否過短；

4，適當增加抗體孵育后的浸洗次數和延長浸洗時間等。