圖1：免疫系統細胞分化圖
Boosting the Immune System–
Steps to Take for Successful Substrate Delivery
嵌合抗原受體表達細胞的產生和基于CRISPR/Cas9的基因組編輯等新技術的建立，為改善或增強免疫應答提供了簡便易行的方案。然而，將底物輸送到我們的目的細胞中是必不可少的-不僅要注重高轉染效率，而且要注重細胞活性、功能性的保存以及患者的健康和安全。此外，傳遞方法在底物方面應該是靈活的，因為編輯細胞基因組的研究人員不僅依賴于質粒DNA的成功轉染，還依賴于RNA和/或蛋白質的成功轉染[1]。
到目前為止，原代免疫細胞的轉染是具有挑戰性的。特別是大家感興趣的細胞類型，如T淋巴細胞、自然殺傷細胞和B細胞，用經典的基于試劑的方法很難轉染[2]。使用轉染試劑的主要問題是轉染效率低、細胞毒性和免疫原性。后者在免疫治療方面是不利的，因為細胞應該維持它們在免疫系統中的功能，而不是被轉染方式預先激活。
實現合理轉染效率的替代方法是病毒轉導，但病毒生產耗時且成本高，另一種方案是改進的電穿孔技術，如NucleofectorTM技術，作為一種物理的方法，它只需要很低的生物安全預防措施(表1)。
表1：不同底物輸送給原代免疫細胞的優缺點綜述
實現免疫細胞
高效基因轉導的三個步驟
步驟1-選擇合適的轉染方法
通過病毒轉導，可以將感興趣的基因整合到宿主基因組中。最常用的是慢病毒載體，慢病毒載體尚不能將目的基因插入到特定位點而是隨機插入。
一種將底物遞送到人體免疫細胞的便捷技術是NucleofectorTM技術，這是一種改進的電穿孔技術。專用的NucleofectorTM解決方案與針對特定細胞類型優化的電轉參數相結合，使研究人員能夠實現高轉染效率和良好的存活率。底物直接輸送到細胞質和細胞核。最小化的免疫原性保留了免疫細胞的功能(圖2)。
圖2：Nucleofection后的細胞功能。條形圖顯示了小鼠樹突狀細胞、人類巨噬細胞和人類T細胞在Nucleofection后的相對功能(樣本)。功能以與未轉染對照(對照)相關的百分比表示。用小鼠樹突狀細胞的IL-6特異性ELISA、人巨噬細胞的TNF-a特異性ELISA、刺激的人T細胞的IFN-g特異性ELISA和CD25特異性抗體(靜息狀態和刺激狀態)流式細胞儀進行功能分析。實驗是在標準的NucleofectorTM設備(小鼠樹突狀細胞)或96孔ShuttleTM系統(人巨噬細胞和人T細胞)上進行的。[3]
NucleofectorTM技術不僅保證了效率和可行性。考慮到表達CAR的T細胞[4]和NK細胞[5]以及基因組編輯[6]，不同底物的共轉染也是可以簡單的實現-在大小和底物類型上具有很大的靈活性，如DNA、RNA和蛋白質。
通過使用4D-NucleofectorTM技術，實現封閉和可擴展的轉染應用。它可以很容易地從用于基礎研究或篩選目的的20-100ul小規模體系到高達20ml的后續應用，例如用于細胞治療的體外修飾。
步驟2-讓你的免疫細胞循規蹈矩
不管底物遞送的方法是什么，免疫細胞在轉染前的狀態決定了之后細胞的活性和功能。細胞對轉染過程的反應有多強烈或敏感，一方面取決于分離過程，另一方面也存在供體特性的問題。
能夠獲得血液或骨髓樣本以自我分離免疫細胞的研究人員，應確保遵守既定的分離、刺激免疫細胞的標準操作程序。嚴格按照說明操作將產生可比較和可重現的結果。
如果無法獲得這種來源，研究人員就會利用商業上可獲得的造血細胞和免疫細胞進行研究。這有利于在質量控制和優化培養系統方面的工作。
然而，無論細胞的來源是什么，原代細胞都是來自單個有機體的細胞。捐贈者特定的差異是不可避免的，并將導致結果差異[7]。
步驟3-準備好穩定的底物遞送
對于病毒轉導來說，病毒顆粒的制備是復雜的，而用于改良電穿孔的底物選擇則更加多樣化。
為了確保最佳的條件，底物應該是高質量的。當我們選擇質粒DNA進行基因遞送時，有許多需要考慮的方面，關于載體DNA的信息可以在Lonza Important Vector Factors for Gene Expression Technical Reference Guide中找到。
底物的大小和濃度是這個游戲中的額外玩家。底物大小本身通常不是影響轉染效率的主要因素，但當質粒大小超過約15kb時，效率會有所下降。因此，在轉染較大的質粒時更要考慮實驗所需的DNA量和質粒的完整性。增加每個反應的DNA含量通常會提高轉染效率，但由于高濃度的DNA可能會對細胞產生毒性，細胞存活率可能會降低。對于Nucleofection實驗，推薦的底物濃度通常在2-5ug/100ul(DNA)、2 nM-2uM(siRNA)和10-20ug/100ul(mRNA)之間。
關于推薦的Nucleofection條件，請在圖一找到找到免疫系統細胞分化的圖表(圖1)。下面的表2總結了大多數這些細胞的轉染條件以及4D-NucleofectorTM系統的參考文獻。
表2：人類原代免疫細胞Nucleofection條件、結果和參考文獻(OP：optimized protocol可用的優化方案，IHD：in-house data基于內部數據)