1、問：做間接法免疫熒光染色，要怎么設置對照？
參考見解：最好是同一視野在未用熒光激發下進行對照，看是否非特異性染色。
（1）空白對照：如果你作的是石蠟切片的免疫組化，這一個對照必須有，目的是看自發熒光。脫蠟后直接在熒光顯微鏡下觀察。
（2）陰性對照：標本直接滴加二抗，呈陰性反應。
（3）抗原對照：標本加同種動物的未免疫血清，以PBS沖洗后，在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動物的血清中無特異性抗體，應呈陰性反應。
2、問：免疫熒光：用免疫熒光方法做同樣的內容，組織切片和培養細胞，兩者操作過程中有哪些不同？
參考見解：只是固定方法不同，細胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一樣的。
（1）你的二抗是用FITC標記的，為避免熒光分解，分裝及熒光顯微鏡觀察時均要避光。
（2）封片最好用甘油加0。5mmol/L pH9。0-9。5的碳酸氫鹽緩沖液，后者能使玻片透明更亮。
（3）關于免疫酶染色，如果是用過氧化物酶做標記，就必須用3%H2O2以去除內緣性過氧化物酶。
（4）如果要做蘇木素復染，可用鹽酸溶液去除蘇木素。
3、問：近期要做免疫熒光雙標，不知哪位有免疫熒光雙標技術的詳細步驟以及注意事項？
參考見解：我正在做冰凍組織切片的免疫熒光的雙染。有些體會：
（1）選取primary antibodies時要來源于兩種不同的動物，我用的是來源于rabbit和rat的抗體，secondary antibodies則是不同熒光信號標記的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。
（2）我的做法是兩種primary antibodies同時孵育，然后兩種secondary antibodies同時孵育。抗體濃度、孵育時間要認真摸索，我感覺primary antibodies 4度孵育過夜比較好，背景比較干凈。
（3）我的陽性對照采用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是rabitt和rat的IgG，熒光標記物對照是PBS+熒光標記物。
（4）Block用的血清使secondary antibody來源動物的血清，我的是10%的正常donkey血清。
（5）其余同一般操作。
4、問：我做乳腺組織的免疫熒光染色，結果用激光共聚焦顯微鏡看很好，有陽性信號，陰性對照組也沒有熒光，但是拿到熒光纖維鏡下看，我的陰性對照組一片綠，像非特異性染色，到底哪個結果才是真實的呢？
參考見解：激光共聚焦顯微鏡的分辨率比普通熒光顯微鏡要高的多，出現上述現象首先要排除熒光顯微鏡的問題，如是不是紫外燈泡壽命到期了或者別的原因，熒光顯微鏡沒有問題，那就以共聚焦顯微鏡的結果為主。抗體分裝、及熒光顯微鏡觀察結果是否一定要在暗室中進行實驗。