免疫熒光技術常見問題與解答

1、問：近期要做免疫熒光雙標，不知哪位有免疫熒光雙標技術的詳細步驟及其注意事項？
 
參考見解：我正在做冰凍組織切片的免疫熒光雙染。我的經驗是：
 
（1）選取一抗時要來源于兩種不同的動物，我用的是來源于rabbit和rat的抗體，二抗則是不同熒光信號標記的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。
 
（2）我的做法是兩種一抗同時孵育，然后兩種二抗同時孵育。抗體濃度、孵育時間要仔細摸索，我感覺一抗4度孵育過夜比較好，背景比較清晰。

 （3）我的陽性對照用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒光標記物對照是PBS+熒光標記物。
 
（4）封閉血清與二抗來源動物一致，我用的是10%的正常donkey血清。
 
（5）其余步驟同一般免疫熒光單標操作。
 
2、問：用免疫熒光方法做組織切片和培養細胞內的蛋白，兩者操作過程有哪些不同？
 
參考見解：只是固定方法不同。細胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一樣的。
 
3、問：本人擬做Brdu標記神經干細胞免疫熒光，二抗為FITC標記，想請教各位大俠：
 
（1）抗體分裝和熒光顯微鏡觀察時是否一定要在暗室中進行？
 
（2）封片時是否用甘油緩沖液即可，還是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液等量混合封片？
 
（3）免疫酶染色中的3%過氧化氫及2N鹽酸是否還需要用？
 
參考見解：
 
（1）你的二抗是用FITC標記的，為避免熒光分解，分裝及熒光顯微鏡觀察時均要避光；
 
（2）封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氫鹽緩沖液，后者能使玻片透明；
 
（3）關于免疫酶染色，如果是用過氧化物酶做標記，就必須用3%H2O2以去除內源性過氧化物酶；2N鹽酸需要使用，目的是使DNA變性，讓Brdu抗體能夠充分地與已經摻入的Brdu結合。
 
4、問：做間接法免疫熒光染色，如何設置對照？
 
參考見解：最好是同一視野在未用熒光激發下進行對照，看是否非特異性染色。
 
（1）空白對照：如果你做的是石蠟切片免疫組化，這個對照必須有，目的是看自發熒光，脫蠟后直接在熒光顯微鏡下觀察。
 
（2）陰性對照：標本直接滴加二抗，呈陰性反應。
 
（3）抗原對照：標本加同種動物的未免疫血清，以PBS沖洗后，在加抗免疫球蛋白熒光抗體。因未免疫動物的血清中無特異性抗體，應呈陰性反應。
 
5、問：我做乳腺組織的免疫熒光染色，結果用激光共聚焦顯微鏡看很好：有陽性信號，陰性對照組也沒有熒光，但是拿到熒光顯微鏡下看，我的陰性對照組一片綠，像非特異性染色，到底哪個結果才是真實的呢？

參考見解：激光共聚焦顯微鏡的分辨率比普通熒光顯微鏡要高的多，出現上述現象首先要排除熒光顯微鏡的問題，如是不是紫外燈泡壽命到期了或者別的原因，熒光顯微鏡沒有問題，那就以共聚焦顯微鏡的結果為主。