實驗概要
了解特異性免疫熒光抗體反應的一般過程及其在細胞學研究中的應用。
實驗原理
用人結腸癌細胞為免疫原，免疫小鼠，制得鼠抗人結腸癌細胞表面抗原(Ag)的單克隆抗體
IgG(第一抗體)，二者可以發生特異性的抗原抗體反應，形成抗原抗體復合物，再加入市售(也可自制)的熒光標記的羊抗鼠 IgG
抗體(第二抗體)，可以與復合物進一步發生抗原抗體反應(二次抗體反應)，這樣就可以在熒光顯微鏡下觀察到這種抗原在結腸癌細胞表面的存在(圖
19—1)。
主要試劑
1640 培養液(加 l0％小牛血清)、甲醛固定液、0.01mol/L PBS(Ph7.2)、液體石蠟。
主要設備
蓋片、載片、培養瓶、培養皿、濾紙、鑷子、吸管、普通倒置顯微鏡，熒光顯微鏡、微量加樣器。
實驗材料
人體結腸癌培養細胞、HeLa 細胞、小鼠抗人結腸癌細胞抗體(第一抗體)、熒光標記羊抗鼠抗體（第二抗體）。
實驗步驟
1. 將培養瓶中的結腸癌細胞接種到裝有蓋片的培養皿中，培養 2～3 天；
2. 在倒置鏡下觀察到蓋片上的細胞生長狀態良好后，在蓋片左上角用玻璃筆做一下標記，以免在以后的操作中正反面顛倒；
3. 將蓋片放在甲醛固定液中，4℃固定 5~10 分鐘；
4. 用 PBS 洗三次，注意不要將 PBS 液直接倒在蓋片的細胞面，以免引起細胞大量丟失。用濾紙片將蓋片上的 PBS 輕輕吸干，不要損傷細胞層；
5. 將已稀釋好的小鼠抗體滴在蓋片上，每個蓋片 50μl，37℃溫育 30 分鐘；
6. 用 PBS 洗三次，濾紙吸干；
7. 將已稀釋好的熒光標記羊抗鼠二次抗體 5μl 滴加在蓋片上，37℃溫育 30 分鐘；
8. 用 PBS 洗三次，濾紙吸干；
9. 將載片上滴一滴液體石蠟。然后將蓋片細胞面朝下放到載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察。