免疫酶細胞化學實驗技術

免疫酶細胞化學

免疫酶細胞化學是免疫細胞化學（Immunocytochemistry,ICC）中最常用的方法之一，它是在抗原抗體特異反應存在的前提條件下，借助于酶細胞化學的手段，檢測某種物質（抗原/抗體）在組織細胞內存在部位的一門新技術：即預先將抗體與酶連結，再使其與組織內特異抗原反應，經細胞化學染色后，于光鏡或電子顯微鏡下觀察分析的形態學研究方法。

　　40多年前，Coons及其同事利用熒光色素（FITC）標記抗體而開創的免疫熒光抗體技術，具有一定的靈敏性、特異性、操作簡單等優點，但亦存在抗體用量大，標本不能長期保存、需較昂貴的熒光顯微鏡等問題。幾乎在同一時期，電子顯微鏡在醫學生物學領域中得到了廣泛的應用。為克服熒光抗體法的不足、并能在超微結構水平定位抗原物質的存在部位，Nakane(1966)等成功地引入了酶代替熒光色素標記抗體，進行組織細胞內抗原或半抗原的定位，開辟了酶標抗體技術免疫酶細胞化學之路。

　　Sternberger（1970）等人在此基礎上又作了改良，建立了非標記抗體酶法以及PAP法。酶標抗體法確立至今已經27個春秋，不斷發展、成熟。各種新技術的引入，使新抗體相繼問世，應運而生的抗體制造、經銷商遍布世界各地，使ICC技術得到了更廣泛的推廣和應用，成為當今形態學研究領域中不可缺少的手段；同時也有為臨床病理診斷、腫瘤性質的判定、預后的估測等提供重要依據，是臨床實驗室常規檢查法之一。近年，伴隨分子生物學、分子遺傳學的驚人進步，ICC技術在基因表達產物的觀察，細胞功能動態分析中，亦發揮著重要作用。在此，結合，筆者經驗，介紹ICC染色中的主要程序：組織標本的固定、切片、染色原理及步驟、結果判定及一些進展、特殊應用等供讀者參考。

第一節　固定和切片

　　一、固定

　　若想得到理想的ICC染色結果、正確地判斷抗原物質在組織細胞內的位置，除需有良好酶和抗體外，保持組織細胞內抗原物質的不動性（Immobility）和免疫活性也是至關重要的。換言之，如果抗原物質在組織細胞間彌散、丟失或失去免疫活性，無論如何努力染色都是徒勞的，所以說固定是ICC染色中非常重要的一環。ICC與其它組織學技術不同，除要求保存良好的結構外，還需保存組織抗原的免疫活性。一般認為，新鮮組織能夠最大限度地保存組織抗原的免疫活性，但結構較差，易出現抗原彌散丟失現象。Cumming（1980）報告，不固定的組織切片ICC染色時，環鳥苷酸含量丟失80%以上。固定的目的是使構成組織細胞成分的蛋白等物質不溶于水和有機溶劑，并迅速使組織細胞中各種酶降解、失活，防止組織自溶和抗原彌散，保持組織細胞的完整性和所要檢測物質的抗原性。因此迅速充分固定是ICC染色成功的關鍵一步。用于ICC的固定劑種類較多，選擇時應根據所要檢測物質的抗原性質和切片方法以及所用抗體特征等做最佳篩選。制片及固定方法見第一章　，下面介紹兩種近年報道的新方法。

　　1．AMEX（Acetone Meth Enzoate Xylene ）法　　是改良的冰凍置換法（freeze substitution）的簡稱，主要用于石蠟包埋標本。Sato(1986)報告，該法具有同新鮮（未固定）組織冰凍切片同樣的抗原保持性和石蠟切片的良好組織結構保存。其機制為：組織在丙酮中固定（脫水），組織細胞內水份逐漸被丙酮取代，繼之，用苯甲酸酯取代組織內丙酮，經二甲苯置換后，石蠟包埋。組織在-20℃丙酮內過夜亦形成冰晶，所以原方法將組織先置4℃丙酮20～30min，再移入-20℃丙酮過夜。實際上組織在4℃丙酮內過夜亦可得到同樣效果。如在該固定液內加入少量蛋白酶活性阻斷劑，并采用低溶點石蠟包埋等，可獲得更佳染色結果。

　　2．微波固定（Microwave fixation）　　為近幾年所注目的問題之一。該方法能保持良好的組織結構和抗原性，適于各種切片的酶組化、ICC以及免疫電鏡等材料固定。其固定機理可能與微波（頻率1000～3000MHz）具有被水分吸收的性質（通常所用的微波是頻率2450MHz，波長12cm）；生物材料含有大量水份，照射后，溫度升高，分子運動加快，促進固定液向組織內滲透，加速與組織成分的反應，短時間內達到固定的效果等有關。經微波照射固定的組織，需置相同固定液中，繼續固定2～6h，室溫。

　　近年研究的專門固定用的微波爐已商品化，例如：Bio-Rad H2500型、日新EM·MWE-2等，該類微波爐能夠準確地調節　照射時間和測定被照材料的瞬時溫度。利用家庭微波爐代替時，應選用能以秒為單位調控的微波爐。實驗材料不同，所需固定液的量、照射時間等各異，所以應在預實驗的基礎上，找出合適的固定液量、照射時間和溫度。多數實驗室的條件為：固定液5～10ml，照射10～30s，照射后固定液的溫度≤50。C。其方法為：將實驗標本置于微波爐旋轉臺的中央，周邊放一燒杯盛300～500ml純水，吸收照射時爐內產生的熱量，選擇強擋照射10～30s 。接通電源（on）至微波產生利用超聲波代替微波照射，或二者并用，照射后，組織標本和固定液的溫度升高較少，亦能獲得短時間內良好的固定效果（Yasuda 1992）。

　　二、切片

　　光鏡ICC染色，常用的有冰凍切片和石蠟切片兩種，二者各有其優缺點，應根據抗原的性質、實驗室條件，合理選擇之。對未知抗原顯示時，最好同時應用。冰凍切片為ICC研究所首選。

　　Shi（1991）等報告：微波爐照射的切片，能夠激活部分核內抗原活性。其機制不清，可能與高溫、高熱的作用，使核內DNA雙鏈解開，DNA、RNA解離，抗原暴露有關。其步驟為：將切片脫蠟水洗后，置染色瓶中，加入去離子水或緩沖液至瓶頸處，反復多次照射，每次1min，照射5～10次，每次照射后，補充瓶中蒸發掉的液體，照射溫度不超過90～95℃為宜。此處理后，細胞核染色以蘇木精為佳

第二節　染色方法

　　一、本科標抗體法

　　酶標抗體技術是通過共價鍵將酶連結在抗體上，制成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成分的定位。

　　（一）酶的種類及特點

　　從理論上講，用細胞化學方法能顯示的酶，均可用于標記抗體，進行ICC染色，但實際上在ICC中所能用的酶并不多。現將常用的幾種酶列于表4-1，供選用時參考。

表4-1 免疫細胞化學常用的酶

　　Sternberger(1986)指出，用于標記的酶應具備以下幾點①酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產物易于光鏡或電鏡下觀察；②所形成的終產物沉淀必須穩定，即終產物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學定位；③較易獲得的酶分子，最好有商品出售；④中性pH時，酶應穩定，酶標記抗體后，保存1～2年活性不應改變，且酶的催化活性（Turnover）越高越好；⑤酶標過程中，酶與抗體連結，不能影響二者的活性；⑥被檢測組織中，不應存在與標記酶相同的內源性酶或類似物質。

　　其中，①②兩點甚為重要，因為并非容易顯示的酶均能形成不可溶性的復合物。一般認為，辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase , HRP）較佳，是最常用的一種酶。HRP廣泛分布于植物界，以植物辣根（西洋山崳菜）的葉內含量最豐富而得名。它是由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結合組成的一種糖蛋白，糖占16%～18（8條糖鏈分布在HRP分子表面），分子量40kD，最適pH5～5.5，最適溫度40～45℃； pH4～11，50℃以下均較穩定，易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。酶的活性中心含鐵卟啉，稱輔基，最大吸收光譜為403nm，而其余非活性的酶蛋白部分吸收光譜為275nm，HRP的純度是用二者的光密度比值（Od 403/275）衡量，Reinheit Zahl (RZ)表示。一般認為，標記酶的RZ值為3.0左右，不應小于2.8，RZ值越小，酶的純度越差，例如RZ值為0.6的酶，含非活性的酶蛋白量高達75%。對于純度低、質量差的酶，需純化后使用。

　　除HRP外，堿性磷酸酶（Alkaline phasphotase, ALP）和葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD）也較常用。ALP分子量約為HRP的2～3倍，最適pH9.0～9.5左右，比較穩定，內源性ALP也較易消除，大部分均可被左旋咪唑（Levamisole,分子量240.8kD）抑制，但腸粘膜表面的內源性ALP活性不受影響。目前所用的ALP大多系由牛的腸粘膜提取制得，所以腸粘膜等呈強陽性反應。

　　ALP最初是由Bulman等用于標記抗體的。選用不同的底物，可形成不同顏色的終產物，例如以萘酚（As-Mx）和快藍（Fast Blue, FB）為底物，生成藍色沉淀。用快紅（Fast Red, FR）代替FB，形成紅色不溶沉淀。與HRP/4-氯-1-萘酚（CN）或DAB形成的沉淀形成鮮明對比，但FB、FR等沉淀物溶于有機溶劑，不能進行脫水、透明等處理。據報告，利用新品紅（New fuch－sine ）顯色，形成的紅色沉淀產物不溶于有機溶劑，不褪色，輕度核復染后，可制成半永久性保存標本。

　　GOD所催化的底物為葡萄糖，電子供體為對硝基四唑藍（P-Nitroblue Tetrazolium）,終產物為不溶性的藍色沉淀，比較穩定。從理論上講GOD較ALP、HRP為佳，因為哺乳動物組織內不存在內源性GOD，但其分子量較大，具有較多的氨基，在標記時易形成廣泛的聚合，影響酶的活性，故GOD主要用于ICC雙重染色和兩種酶的放大技術。

　　（二）本科標抗體的制備（Boosma,DM, 1983）

　　酶標抗體與熒光色素標記抗體不同，它需借助橋-偶聯劑的作用，將酶連結在抗體分子上。偶聯劑是一種雙功能試劑，具備3個基本特征：①偶聯劑與抗體和酶之間的連結，必須是不可逆的，即借共價鍵連結；②偶聯劑不應影響酶和抗體的活性；③不能因偶聯劑的加入，使酶與組織成分了生非特異結合。

　　在HRP標記抗體中，常用的偶聯劑有戊二醛、過碘酸鈉及Maleimide等，現簡介如下。

　　1．戊二 醛標記法　　戊二醛為制備各種酶標抗體最常用的偶聯劑。市售戊二醛往往含有戊二酸、丙烯釋及戊二醛自身聚合本等雜質，故需純化后使用。戊二醛的純度用含雜質的二醛的單體戊二醛的OD比值表示，它們的最大吸收光波長分別為235nm 和280nm，二者的OD比值（235/280）小于3時，制備酶標抗體的效果較好，大于3時，需經蒸餾或Sephadex G-10柱層析或活性碳吸附等處理，除去雜質后應用。其制備方法分一步法和兩步法；基本原理相同，是使戊二醛的兩個醛基之一與酶蛋白的賴氨酸結合，另一醛基與免疫球蛋白上的氨基結合，將酶連結于抗體上。

　　（1）一步法：將酶、抗體、戊二醛按一定比例混合，經透析除去標記物中剩余的戊二醛，制得酶標抗體。優點是簡單省時，缺點是反應程度不易被控制，因為酶蛋白分子和抗體蛋白分子同戊二醛間的反應速率不同，抗體蛋白的氨基數遠較HRP為多，與戊二醛反應快，因此在戊二醛的作用下，抗體蛋白易通過分子內和分子間的彼此交聯，形成較大的聚合體，而與酶蛋白分子間的交聯相應減少，影響酶的標記。據Nakane等推算，加入的HRP僅20%與抗體連結，標記率較低（約1%～5%）很難獲得理想的酶標抗體。

　　（2）二步法：首先用過量的戊二醛與HRP反應（HRP：戊二醛為1：105），以保證酶分子僅與戊二醛的一個醛基結合，另一個醛基游離；然后用層析法除去多余的戊二醛，制成活性HRP（HRP-戊二醛復合物），再加入過量的抗體，使活化HRP上剩余的醛基與抗體蛋白分子上的氨基結合，制成酶標抗體。過量的抗體可以保證酶與抗體間均勻連結，避免酶本身聚合。根據所用的HRP與抗體（IgG）比例不同，酶標記率各異，平均為5%～25%。標記步驟如下：

　　①10～15mg HRP(RZ=3.0),溶解于0.2ml 1.25%戊二醛中（0.1mol/L磷酸緩沖液配制），18h室溫。

　　②透析或 Sephadex G-25柱層析（0.15mol/l NaCl平衡），去除過量的戊二醛，收集活化HRP。

　　③濃縮活化HRP至10mg/ml左右，加入抗體5mg(1.0ml 0.15mol/L NaCl 溶解)。

　　④碳酸鹽緩沖液（pH9.5）調整pH至9.0～9.5,使抗體與活化HRP結合，4℃24h。

　　⑤加入0.1ml賴氨酸緩沖液，阻斷未反應的醛基，4℃，2h。

　　⑥用半飽和硫酸銨沉淀5次，對PBS透析24h，4℃，換3次PBS，除去硫酸銨（10000rpm/min,30min）。

　　⑦或用凝膠色譜法（Sephadex G-200/Sephacryl S-200） 等分離標記抗體。

　　注意：該方法要求HRP的RZ值在3.0左右，游離氨基較少，與戊二醛反應后，制成的酶標抗體大部分為單體；而RZ值小于2.8的HRP，含有較多的游離氨基，與戊二醛反應后，易形成多聚體，使方法的敏感性下降。

　　2．過碘酸鹽氧化法　　嚴格地講，過碘酸鈉（Sudium periodate）不是一種真正的偶聯劑，其本身并非作為橋連結在抗體和酶之間，而是借助于過碘酸鈉的氧化作用，將酶連結在抗體上。該方法僅適于含糖較豐富的酶（如HRP）的標記。我們知道，HRP分子的糖本身與酶活性無關，利用過碘酸鈉氧化這部分糖分子內的-CH基，使之生成-CHO基，再與抗體蛋白的游離氨基反應，生成Shiff’s堿。此Shiff’堿在pH降低時呈可逆性解離，所以經氫硼化鈉（NaBH4）還原，形成穩定的酶標抗體復合物（圖4-1）。為防止生成的-CHO基與酶蛋白氨基自身交聯，預先可用二硝基氟苯（Dintro-fluorobenzene）處理HRP，阻斷分子內的ε-、α-氨基。

　　過碘酸鹽氧化法，酶的RZ值≥3時較佳；RZ<3時，糖含量較少，游離氨基較多，氧化時酶易發生本身聚合，影響酶標抗體的產量，據報告，適當地控制過碘酸鹽溶液及反應條件，幾乎所加入的HRP和抗體均形成酶標抗體，其標記率為70%左右。具體步驟為：

　　（1）4mg HRP(RZ=3.0)溶于1.0ml雙蒸水中。

　　（2）加0.2ml新鮮配制的0.1mol/LNaIO4，輕輕搖動混合20min,肉眼可見液體內棕黃變成深綠色。

　　（3）對0.1mol/L醋酸鹽緩沖液（pH4.4）透析，20h，4℃。

　　（4）調整HRP液體的pH至9.5(一般加入20μl0.2mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.5),立即加入抗體(IgG)8.0mg/Fab 3.0mg (0.01mol/L碳酸鹽緩沖液溶解),輕輕混勻后,置室溫2h。PH≤8.5時,抗體的NH2基被氧化生成NH3+,后者不能與CHO基反應,所以,保持pH9.0～9.5非常重要。

　　（5）加入0.1ml新鮮配制的0.4%NaBH4 溶液，置1～4℃2h，以穩定酶標抗體復合物。

　　（6）經透析等去除未反應的NaBH4 ，避免還原過度。然后經鹽析或柱層析等方法分離酶標抗體（方法同戊二醛法）。

　　如此制得的酶標抗體，加入終濃度1%牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）分裝后于-80℃可保存數年；亦可加入6%等量甘油，混勻置-20℃/4℃保存1年左右。上述兩種標記法是ICC研究中最常用的酶標抗體制備方法。