圖1:

圖2:

圖1左邊是黑色的是對照組的突觸密度,右邊黑色的是敲除組的突觸密度,明顯下降!圖2測定的是場興奮性突觸后電位,黑色的是對照組的LTP長時程增強,紅色的是敲除組的LTP長時程增強,明顯突出的可塑性受損!
這些突觸密度的下降、突觸可塑性的受損,反應到行為學上則是學習認知的問題。
采用荷蘭諾達思的Cognition Wall認知墻工具進行學習認知行為的研究

Cognition Wall認知墻工具包含EthoVision軟件系統以及PhenoTyper小鼠家居箱以及三孔認知墻等。動物從特定的入口進入(上圖顯示綠色的入口),則軟件自動給予食物獎勵(上圖藍色的顆粒顯示)該實驗全程自動,不需要人為干預,軟件自動控制硬件并自動記錄數據并自動分析數據。
實驗如下:
實驗前一周小鼠在標準的鼠籠單籠飼養;
實驗開始前11個小時前將小鼠放入小鼠家居箱,讓其適應環境,即大約晚上8:30將小鼠放入,可以進水限制進食;
這個適應階段放入10粒食物,使小鼠能找到食物給予的地方
早上7:30放入認知墻,早上8:00開始實驗,全程自動進行;
這個過程小鼠需要連續進入左邊的孔5次則軟件自動控制硬件給予一粒食物(即上圖綠色的孔)。
Tip:本文的小鼠節律是晚上8點開燈至第二天早上8點關燈,后期采用紅色昏暗的燈光作為晚上時間,即light phase 8:00pm-8:00am dark phase 8:00am-8:00pm其中dark phase為實驗進行時段。
以下圖示為實驗結果:

從從結果可以看出,基因敲除的紅色線的小鼠只有40%的學會了認知墻!對照組全部學會!對比明顯!
在一天后的記憶測試階段,將小鼠重新放回帶有認知墻的家居箱,在1個小時的測試中計算小鼠做出正確選擇的比例(即從左邊孔進入)。

從結果可以看出,基因敲除的紅色線的小鼠做出正確選擇的比例明顯低于對照組。
為了確保食物獎勵的裝置沒有問題,實驗者亦手動數了每只小鼠在學習過程中獲得的食物獎勵的數目,因為食物獎勵的數目與小鼠的學習能力是相關的。

明顯,基因敲除的小鼠獲取食物獎勵的數目少于對照組,學習能力明顯弱于對照組。
沒有完!在小鼠模型上注射C端激酶的病毒進行挽救實驗,對照組、激酶組、突變激酶組,一個月后做行為學測試后處死進一步分析,新物體識別的認知參數,對照組和激酶組都明顯高于突變激酶組。學習認知實驗中,對照組和激酶組都明顯學習得更快,記憶測試也更多地做出了正確的選擇。當然突觸密度與突觸可塑性均高于突變組。

這和最開始的細胞實驗對應了起來,在動物模型上并且是行為實驗上驗證了C端激酶對學習記憶的關鍵作用。
當然以大鼠為模型,在特定knockdown的大鼠,確定敲低其表達以后,同樣基本的行為參數是沒有差異的,后測定大鼠的學習與記憶能力,T迷宮空間學習實驗(敲低后做出正確選擇的比例明顯下降)、短期再認記憶(過去經驗或識記過的事物再次呈現在面前時仍能確認和辨認出來的過程)也受損、背景記憶也受損,當然突觸密度與突觸可塑性均明顯下降 。

最后一個話題,文獻報道過cofilin參與的一些功能和TRPM7敲除后很類似,提出假設在學習認知層面TRPM7可能借助cofilin參與了下游的機制,發現敲除后cofilin磷酸化(抑制)顯著減少,而激酶組的cofilin確實磷酸化得到了恢復,并驗證了兩者是直接結合的。
當然下游這塊研究還是比較簡單,偏向于現象的關聯,未能直接與學習記憶做深入研究。另外,激酶的功能是通過突觸前、突觸后來調控突觸密度的機制也需要進一步闡明。