共聚焦熒光探針標記方法

（一）BCECF測定pH值

1. 儲存液配制 BCECF-AM溶于DMSO配成1mmol/L溶液，等份分裝后，－20℃避光保存。

2. 染色步驟 將培養細胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。加入BCECF-AM（終濃度1～5μmol/L），37℃孵育30～60min。PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

（二）SNARF-1定量比率測定pH值

1． 儲存液配制　SNARF溶于DMSO配成1mmol/L溶液，等份分裝后，－20℃避光保存。

2． 染色步驟　將培養細胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。加入SNARF-1-AM（終濃度1～5μmol/L），37℃孵育30～60min。PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

（三）Indo-1測定細胞內Ca2+

1． 儲存液配制　Indo-1（分子量為840），活細胞標記常選用Indo-1 AM，分子量為1010，呈干粉狀，將其溶于DMSO配成1mmol/L溶液，等份分裝后，避光冷藏保存。

2． 染色步驟　將培養細胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。加入Indo-1 AM（終濃度1～5μmol/L），37℃孵育30～60min。用PBS（含Ca22+、Mg2+）洗2遍。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

也可用弱的去垢劑Pluronic F-127助染。可將Pluronic F-127溶于DMSO配成20%（W/V）的溶液，終濃度1%～2%。

（四）Fluo-3測定細胞內Ca2+

1. 儲存液配制　Fluo-3（分子量為855），活細胞標記常選用Fluo-3 AM，分子量為1130，呈橙色粉狀，避光冷藏保存或將其溶于DMSO配成1mmol/L溶液，等份分裝后，避光冷藏。

2. 染色步驟 將培養細胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。加入Fluo-3 AM（終濃度1～5μmol/L），37℃孵育30～60min。用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

可用Pluronic F-127助染。方法同上。

（五）CFDA測定細胞間通訊

1．儲存液配制 CFDA即5-（6）-羧基熒光黃乙酰乙酸鹽（5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate ，5(6)-CFDA），分子量為460.40，用乙醇或DMSO配成10mg/ml溶液，等份分裝后，避光冷藏。

2． 染色步驟 將培養細胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍。加入CFDA溶液（終濃度10-20ug/ml），37℃孵育10～15min。用PBS（含Ca2++、Mg2+）洗2遍。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

（六）DiBAC4測定細胞膜電位染色步驟

1． 培養細胞用DiBAC4孵育，37℃，10～20min，終濃度2～5μmol/L。

2． 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，實驗中注意將細胞內外的DiBAC4濃度保持一致。如果細胞去極化，如增加溶液的KCl濃度10～15μmol/L，DiBAC4熒光強度增強。

（七）Rhodamine 123標記活細胞線粒體染色步驟

培養細胞用PBS（含Ca2+、Mg2+）洗2遍加入Rhodamine 123溶液（終濃度1μg/ml），37℃孵育10～30min用PBS沖洗2遍激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

（八）AO顯示RNA和DNA染色步驟

培養細胞用95%酒精固定10～15min，干燥。1%醋酸酸化30s。0.01%AO染色5～10min。PBS（pH 4.8）洗1min。0.1mol/L CaCl2分化30s或用水洗數分鐘。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

（九）PI顯示DNA染色步驟

培養細胞用PBS洗2遍，離心。棄上清液留0.5ml，用PBS將細胞密度調整為1×106/ml。加入濃度為5mg/50ml的 RNAase   0.5ml， 37℃消化30min。取出放入冰浴中，加入濃度為5mg/100ml的PI  1.5ml ， 染色至少30min。300目尼龍網過濾。共聚焦顯微鏡觀察。

思 考 題

1． 試述激光掃描共聚焦顯微鏡的基本原理及主要功能。

2． 如何選擇共聚焦激光掃描顯微鏡的熒光探針？

3． 設計一個用Fluo-3測定細胞內Ca2+的實驗程序。