乙酰-CoA進入由一連串反應構成的循環體系，被氧化生成H?O和CO?。由于這個循環反應開始于乙酰CoA與草酰乙酸(oxaloaceticacid)縮合生成的含有三個羧基的檸檬酸，因此稱之為三羧酸循環或檸檬酸循環(citratecycle)。在三羧酸循環中，檸檬酸合成酶催化的反應是關鍵步驟，草酰乙酸的供應有利于循環順利進行。其詳細過程如下：
1、乙酰-CoA進入三羧酸循環
乙酰CoA具有硫酯鍵，乙酰基有足夠能量與草酰乙酸的羧基進行醛醇型縮合。首先檸檬酸合酶的組氨酸殘基作為堿基與乙酰-CoA作用，使乙酰-CoA的甲基上失去一個H+，生成的碳陰離子對草酰乙酸的羰基碳進行親核攻擊，生成檸檬酰-CoA中間體，然后高能硫酯鍵水解放出游離的檸檬酸，使反應不可逆地向右進行。該反應由檸檬酸合酶(citratesynthase)催化，是很強的放能反應。由草酰乙酸和乙酰-CoA合成檸檬酸是三羧酸循環的重要調節點，檸檬酸合酶是一個變構酶，ATP是檸檬酸合酶的變構抑制劑，此外，α-酮戊二酸、NADH能變構抑制其活性，長鏈脂酰-CoA也可抑制它的活性，AMP可對抗ATP的抑制而起激活作用。
2、異檸檬酸形成
檸檬酸的叔醇基不易氧化，轉變成異檸檬酸而使叔醇變成仲醇，就易于氧化，此反應由順烏頭酸酶催化，為一可逆反應。
3、第一次脫氫——異檸檬酸脫氫酶
在異檸檬酸脫氫酶作用下，異檸檬酸的仲醇氧化成羰基，生成草酰琥珀酸(oxalosuccinicacid)的中間產物，后者在同一酶表面，快速脫羧生成α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)、NADH和CO2，此反應為β-氧化脫羧，此酶需要鎂離子作為激活劑。此反應是不可逆的，是三羧酸循環中的限速步驟，ADP是異檸檬酸脫氫酶的激活劑，而ATP，NADH是此酶的抑制劑。
4、第二次脫氫——α-酮戊二酸脫氫酶
在α-酮戊二酸脫氫酶系作用下，α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰-CoA、NADH·H+和CO?，反應過程完全類似于丙酮酸脫氫酶系催化的氧化脫羧，屬于α-氧化脫羧，氧化產生的能量中一部分儲存于琥珀酰coa的高能硫酯鍵中。α-酮戊二酸脫氫酶系也由三個酶(α-酮戊二酸脫羧酶、硫辛酸琥珀酰基轉移酶、二氫硫辛酸脫氫酶)和五個輔酶(tpp、硫辛酸、hscoa、NAD+、FAD)組成。此反應也是不可逆的。α-酮戊二酸脫氫酶復合體受ATP、GTP、NADH和琥珀酰-CoA抑制，但其不受磷酸化/去磷酸化的調控。
5、底物磷酸化生成ATP
在琥珀酸硫激酶(succinatethiokinase)的作用下，琥珀酰-CoA的硫酯鍵水解，釋放的自由能用于合成gtp，在細菌和高等生物可直接生成ATP，在哺乳動物中，先生成GTP，再生成ATP，此時，琥珀酰-CoA生成琥珀酸和輔酶A。
6、第三次脫氫——琥珀酸脫氫酶
琥珀酸脫氫酶(succinatedehydrogenase)催化琥珀酸氧化成為延胡索酸。該酶結合在線粒體內膜上，而其他三羧酸循環的酶則都是存在線粒體基質中的，這酶含有鐵硫中心和共價結合的FAD，來自琥珀酸的電子通過FAD和鐵硫中心，然后進入電子傳遞鏈到O?，丙二酸是琥珀酸的類似物，是琥珀酸脫氫酶強有力的競爭性抑制物，所以可以阻斷三羧酸循環。
7、延胡索酸的水化
延胡索酸酶僅對延胡索酸的反式雙鍵起作用，而對順丁烯二酸(馬來酸)則無催化作用，因而是高度立體特異性的。
8、第四次脫氫——蘋果酸脫氫酶（草酰乙酸再生）
在蘋果酸脫氫酶(malicdehydrogenase)作用下，蘋果酸仲醇基脫氫氧化成羰基，生成草酰乙酸(oxalocetate)，NAD+是脫氫酶的輔酶，接受氫成為NADH·H+。
在此循環中，最初草酰乙酸因參加反應而消耗，但經過循環又重新生成。所以每循環一次，凈結果為1個乙酰基通過兩次脫羧而被消耗。循環中有機酸脫羧產生的二氧化碳，是機體中二氧化碳的主要來源。在三羧酸循環中，共有4次脫氫反應，脫下的氫原子以NADH+H+和FADH2的形式進入呼吸鏈，最后傳遞給氧生成水，在此過程中釋放的能量可以合成ATP。乙酰輔酶A不僅來自糖的分解，也可由脂肪酸和氨基酸的分解代謝中產生，都進入三羧酸循環徹底氧化。并且，凡是能轉變成三羧酸循環中任何一種中間代謝物的物質都能通過三羧酸循環而被氧化。所以三羧酸循環實際是糖、脂、蛋白質等有機物在生物體內末端氧化的共同途徑。三羧酸循環既是分解代謝途徑，但又為一些物質的生物合成提供了前體分子。如草酰乙酸是合成天冬氨酸的前體，α-酮戊二酸是合成谷氨酸的前體。一些氨基酸還可通過此途徑轉化成糖。