照高效液相色譜法（通則0512）測定，臨用新制。
溶劑
見有關物質項下。
供試品溶液
取本品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺溶解并定量稀釋制成每1mL中約含0.8mg的溶液，精密量取1mL，置10mL棕色量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。
對照品溶液
取兩性霉素B對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺溶解并定量稀釋制成每1mL中約含0.8mg的溶液，精密量取1mL，置10mL棕色量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻。
色譜條件
用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈磷酸溶液（pH1.00±0.05）（370:630）為流動相，流速為每分鐘0.8mL，柱溫為25°C，檢測波長為383nm，進樣體積10μL。
系統適用性要求
對照品溶液色譜圖中，兩性霉素B峰與相鄰雜質峰間的分離度應符合要求。
測定法
精密量取供試品溶液與對照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算。每1mg的C47H73NO17相當于1049兩性霉素B單位。