甲烷的生物合成有 3 種途徑，包括以乙酸為底物，以 H2/CO2 為底物，以甲基類化合物為底物的生物合成過程。研究表明，以乙酸鹽為底物產生的甲烷占自然界甲烷量的 67%，而以 H2/CO2轉化形成的甲烷不足自然界甲烷量的33%。很多獨特的酶類參與甲烷生成過程，這些酶類主要有氫化酶、輔酶F420、甲酰甲基呋喃、甲酰四氫甲基喋呤、輔酶 M 等，通過監測產甲烷過程中的獨特酶類，可以從本質上認識產甲烷菌的代謝規律。三種甲烷合成途徑最終都形成甲基輔酶 M，甲基輔酶 M 在甲基輔酶 M 還原酶Ⅰ (MCR Ⅰ)和甲基輔酶 M 還原酶Ⅱ (MCR Ⅱ)的催化下最終形成甲烷。