先天代謝障礙種類繁多，診斷比較困難，最后的確診有賴于特異性實驗室檢查。臨床表現可以提供一些診斷探索，分析患者病程及發病特點，病史、體格檢查、家系譜可作出初步診斷，再選擇進行相應的實驗室檢查，就可能明確診斷。例如：在新生兒期出現危重的代謝異常，尤其是酸中毒，并伴嘔吐、哺乳困難，就可能是糖代謝異常。患者的特殊氣味也可能有診斷意義，因為在體內累積的代謝產物有些可以由尿、汗排出，而有些代謝物則有特殊氣味；鼠尿味可見于苯丙酮酸尿癥；燒焦的糖味見于楓糖尿癥；汗腳臭味見于異戊酸血癥及其他一些有機酸代謝病；啤酒花味見于氨酸吸收不良癥等皮膚和毛發的異常往往也提示了重要的診斷線索；皮膚色素增多見于腎上腺腦白質營養不良，皮膚及毛發色淺見于苯丙酮酸尿癥或白化病，毛發脆易折見于先天性銅代謝異常（門克斯氏病）等。
先天代謝障礙的實驗室檢查一般可分兩步進行。第一步是用較簡單的方法進行篩查，若得陽性結果再進行特異性生物化學檢查，前者可在一般醫院的化驗室進行，后者則往往必須在專門的醫學實驗室才能完成。
新生兒篩查是先天代謝障礙診斷的一個重要方面，但只用于那些在臨床癥狀出現之前就可能出現生物化學異常，并且這些代謝異常目前已有治療方法，而且患者如果不進行治療日后就會有較嚴重殘疾的先天代謝障礙。目前應用最廣的篩查方法是格思里氏細菌抑制試驗，即將新生兒的血滴在特定的濾紙上，將統一直徑的濾紙片放在接種有依賴某種代謝物才能生成的枯草桿菌株的培養基上，憑濾紙片周圍細菌生長的寬度對濾紙片中含有此種代謝物的量作出大致估計。這種方法選用不同的枯草桿菌變異株，可用于診斷苯酮酸癥，楓糖尿癥、組氨酸血癥、蛋氨酸血癥等多種氨基酸代謝異常以及半乳糖血癥等其他先天代謝障礙。此外，先天性甲狀腺功能低下和先天性生物素基酸缺陷也已在世界各地和中國一些地區開展了新生兒篩查，這兩種疾病一旦在新生兒期得到診斷,可分別給予口服甲狀腺素或生物素,能有效地防止日后出現智力低下及其他癥狀。
先天性代謝障礙的另一類診斷內容是異常基因攜帶者的檢出，因為絕大多數先天代謝障礙屬常染色體隱性遺傳，有一部分人體內有一個異常基因，雖然本人未患病，但與人群中其他帶有同種異常基因的雜合子婚配后，子女中卻有25%的可能患病，所以雜合子的檢出有很大意義。一般必須進行代謝物或酶活性的特異性檢查，方法比較復雜，目前可以進行此項檢查的先天代謝障礙已達數十種。