1、凝膠的選擇
根據層析物質分子量的大小選擇不同型號的凝膠，如除鹽和除游離的熒光素，則可選用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分離蛋白質單體，G200多用于分離蛋白質凝膠聚合體等。
2、凝膠預處理
稱取適量的凝膠加入過量的緩沖液在冰箱（或室溫）中充分膨脹，或在沸水中煮，膨脹時間應根據不同型號的凝膠而定（）。
為使粒子均勻一致需進行浮選，即加入凝膠粒子后，輕輕攪拌，靜置20min，傾去沉淀的粒子，如此反復數次即可。
3、裝柱
層析柱的選擇一般根據分離樣品的種類和樣品的數量而定。純化蛋白質時，柱床體積應為樣品體積的25～100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的4～10倍。柱太短，影響分離效果。柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時間，樣品也稀釋過度。層析柱的內徑也要選擇適當。內徑過細，會發生“器壁效應”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內徑和高度應有一定的比例。對于除鹽來說應為1︰5～1︰25；對于純化蛋白質來說應為1︰20～1︰100。
裝柱過程基本同離子交換層析柱。
4、加樣與洗脫
樣品體積不宜過多，最好為床體積的1%～5%，最多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大，濃度過大粘度大，分離效果差，一般不超過4%。
洗脫液應與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會發生變化，影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強度和pH值。分離血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液（0.14Mol/L NaCl）。
5、洗脫液收集
同離子交換層析。