① 發熱及表現其他全身癥狀的小兒，如同時出現小泡狀皮疹，應疑及本病。特別要重視口唇及其附近的皮膚和粘膜，如見頰內和牙齦發生小濾泡或小潰瘍，更屬可疑。
② 可從局部病變（包括水泡液、咽拭子、腦脊液等）在4天內分離病原毒。如無條件作病毒分離，可將水泡內容物接種于兔的角膜劃痕，如檢查角膜細胞涂片時看到典型的嗜酸性包涵體，可證實診斷。
③ 從皰疹或潰瘍采取刮除物標本，涂片作鏡檢，以蘇木紫和伊紅染色可見典型的核內包涵體和多核巨細胞，也可利用免疫熒光技術或電鏡檢查證實病原體。
④ 雙份血清檢查抗體對原發性感染很有幫助，一般可見痊愈期抗體滴度超過急性期水平四倍或更高。
單純皰疹性口炎須與腸道病毒所致的皰疹性咽峽炎鑒別，后者流行于夏秋季，以驟起發熱、拒食、流涎與吞咽時疼痛為主，偶見嘔吐與腹瀉，其口腔病變主要出現在咽峽及軟腭，不象單純皰疹那樣涉及頰內粘膜、舌及牙齦，因此鑒別較易。此外，還要與波及口唇和鼻孔口的傳染性膿皰病、局限于外陰部的白色念珠菌外陰陰道炎等相區別。