青霉素G生產可分為菌種發酵和提取精制兩個步驟。①菌種發酵：將產黃青霉菌接種到固體培養基上，在25℃下培養7～10天，即可得青霉菌孢子培養物。用無菌水將孢子制成懸浮液接種到種子罐內已滅菌的培養基中，通入無菌空氣、攪拌，在27℃下培養24～28h，然后將種子培養液接種到發酵罐已滅菌的含有苯乙酸前體的培養基中，通入無菌空氣，攪拌，在27℃下培養7天。在發酵過程中需補入苯乙酸前體及適量的培養基。②提取精制：將青霉素發酵液冷卻，過濾。濾液在pH2～2.5的條件下，于萃取機內用醋酸丁酯進行多級逆流萃取，得到丁酯萃取液，轉入pH7.0～7.2的緩沖液中，然后再轉入丁酯中，將此丁酯萃取液經活性炭脫色，加入成鹽劑，經共沸蒸餾即可得青霉素G鉀鹽。青霉素G鈉鹽是將青霉素G鉀鹽通過離子交換樹脂（鈉型）而制得。