慶大霉素是一種氨基糖苷類藥。其作用機制是作用于細菌體內的核糖體，抑制細菌蛋白質合成，并破壞細菌細胞膜的完整性。慶大霉素可首先經被動擴散通過細胞外膜孔蛋白，然后經轉運系統通過細胞膜進入細胞內，并不可逆地結合到分離的核糖體30S亞基上，導致A位的破壞，進而:
1.阻止氨tRNA在A位的正確定位，尤其是妨礙甲硫氨酰tRNA的結合，從而干擾功能性核糖體的組裝，抑制70S始動復合物的形成。
2.誘導tRNA與mRNA密碼三聯體錯誤匹配，引起完整核糖體的30S亞基錯讀遺傳密碼，造成錯誤的氨基酸插入蛋白質結構，導致異常的、無功能的蛋白質合成。
3.阻礙終止因子與A位結合，使已合成的肽鏈不能釋放，并阻止70S完整核糖體解離。
4.阻礙多核糖體的解聚和組裝過程，造成細菌體內的核糖體耗竭。慶大霉素對銅綠假單胞菌、變形桿菌（吲哚陽性和陰性）屬、大腸桿菌、克雷白菌屬、腸桿菌屬、沙雷菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬、奈瑟菌、金黃色葡萄球菌（不包括耐甲氧西西林菌株）有較強的抗菌活性。慶大霉素對鏈球菌（包括化膿性鏈球菌、肺炎球菌、糞鏈球菌等）、厭氧菌（擬桿菌屬）、結核桿菌、立克次體、病毒和真菌無效。