大劑量鞘內注射可致驚厥和其它難以處理的副作用，主要表現在神經系統。
甲氨蝶呤應在有用細胞毒藥物經驗的醫師持續地監督下使用，并應確認用藥的益處大于潛在的危險性，應該告訴病人甲氨蝶呤的毒性和致命的副作用及其危險性，用藥后應認真隨訪病人以便盡早發現副作用，應有適當的設施來處理可能發生的并發癥。
1. 常規：對于有感染、消化性潰瘍、潰瘍性結腸炎、體弱、年齡太小或年老的病人應慎用甲氨蝶呤。當考慮使用甲氨蝶呤作為化療藥時，醫師應權衡利弊，大部分不良反應若早期發現將是可逆的。若出現不良反應，可以降低劑量或停藥并進行恰當的處理。
2. 大劑量治療：大劑量甲氨蝶呤僅能由專家，并在有必須的設備和人員的醫院內使用，同時應采用“甲酰四氫葉酸解救”，大劑量療法不適用于腎功能受損，或有腹水或大量胸腔積液等液體潴留的病人。要密切監測腎功能和甲氨蝶呤血清水平以發現潛在的毒性，為防止酸性尿液條件下藥物的腎臟蓄積，建議堿化尿液及增大尿量。
感染或免疫狀態
1. 活動性感染、胃潰瘍和潰瘍性結腸炎患者應慎用甲氨蝶呤，甲氨蝶呤有免疫抑制作用，有可能導致嚴重甚至致命感染，在免疫反應對患者而言可能是非常重要或必要時，評估藥品的使用必須要考慮該因素。
2．可能發生肺炎(某些情況會導致呼吸衰竭)，由于甲氨蝶呤治療，會發生潛在致死性機會性感染，特別是卡氏肺囊蟲性肺炎，患者出現肺部癥狀時，應考慮卡氏肺囊蟲性肺炎的可能性。
3. 有明顯的或實驗室檢查證實的免疫缺陷患者通常禁止使用甲氨蝶呤。
4. 在治療期間的免疫接種可能是無效的，一般不推薦接種病毒疫苗。曾報告患者在甲氨蝶呤治療期間患者給天花疫苗后發生播散性痘苗感染。
操作注意事項
與處理所有抗腫瘤制劑相同，配制甲氨蝶呤注射液（BP）必須由受過訓練的專業人員在指定地點完成（最好在細胞毒性層流柜中），在操作過程中應戴防護手套，如果溶液意外地與皮膚或粘膜接觸，污染部位應立即用肥皂和清水徹底清洗。
建議使用配有Luer-lock的注射器，建議使用大孔針頭以減少壓力，避免形成氣霧。在配制藥液過程中，使用帶排氣孔的注射針頭，也可減少氣霧的形成。
配制甲氨蝶呤所有物品或和軀體有關的廢物應裝入雙層密封的聚乙烯口袋中，在1100℃下焚化。
泄漏和處置
如果發生泄漏，限制進入污染區域，戴雙層手套（乳膠），呼吸面罩，防護罩衣和護目鏡，用紙、“CHUX”、鋸屑或細小碎屑來吸附泄漏物，限制其擴展，泄漏物也可用5%次氯酸鈉處理。從泄漏區域收集吸附性物質和碎屑，置于防漏的塑料容器中，貼上相應的標簽，細胞毒性廢棄物作為有害和有毒物質，應明確標上“細胞毒性廢棄物，于1100℃下焚燒”字樣，廢棄物應1100℃下焚燒1秒鐘（廢棄藥瓶分解為H2O及CO2），隨后用大量的清水沖洗污染區域。