肌內注射后達峰時間為0.5小時～1小時。血漿蛋白結合率約為50%，本品透過血腦屏障的量甚微。部分經肝細胞代謝轉化為谷氨酸鹽。主要經腎（約40%～90%）排泄，大多以原形藥排出體外；約10%通過膽汁排泄，半衰期（t1/2α）為1小時；半衰期（t1/2β）為二室型：初期為2～3小時；終末期為8～10小時。少量甲氨蝶呤及其代謝產物可以結合型形式貯存于腎臟和肝臟等組織中，可長達數月，在有胸腔或腹腔積液情況下，本品的清除速度明顯減緩；清除率個體差別極大，老年患者更甚。
