是確診肺結核最特異性的方法，痰中找到結核菌是確診肺結核的主要依據。涂片抗酸染色鏡檢快速簡便在我國非典型分枝桿菌尚屬少見，故抗酸桿菌樣應，肺結核診斷基本即可成立。直接厚涂片陽性率優于薄涂片，為目前普通采用。熒光顯微鏡檢查適合于大量標本快速檢查。無痰或兒童不會咳嗽，可采用清晨的胃洗液找結核菌，承認亦可通過纖支鏡進差，或從其涮洗液汁中國查找結核菌。痰菌陽性表明其病灶是開放性的，輿論傳染性。若排菌量多（每毫升10萬個以上），直接涂片易呈陽性，為社會傳染源于痰菌量較少（每毫升1萬個以下），可用集菌法。培養法更為精確，除能了解結核菌有無生長繁殖能力外，且可作藥物敏感試驗與菌型鑒定。結核菌生長緩慢，使用改良羅氏培養基，通常需4－8周才能報告。培養雖較費時，但精確可靠，特異性高，若涂片陰性或診斷有疑問時，培養尤其重要，培養菌株進一步作藥物敏感性測定，可為治療特別是復治時提供參考。將標本在體外用聚合酶鏈反應（PCR）法，使所含微量結核菌DNA得到擴增，用電泳法檢出，1個結核菌約含1fgDNA，40個結核菌即可有陽性結果。該法不必體外預培養，特異性強，2天即可出報告，快速、簡便，并可鑒定菌型，不足之處是可能出現假陽性或假陰性。