β-瓊脂糖酶切割瓊脂糖亞單位或未置換的新瓊脂乙糖（3,6-酐-α-L-吡喃型半乳糖基-1-3-D-半乳糖）生成新瓊脂-寡糖（1）。β-瓊脂糖酶 I 消化瓊脂糖，形成不能再成膠的碳水化合物分子，同時釋放所俘獲的 DNA。通常殘留的碳水化合物分子或 β-瓊脂糖酶 I 不會影響隨后的限制性內切酶消化、連接反應及轉化反應等 DNA 操作。
