紙層析法依據極性相似相溶原理，是以濾紙纖維的結合水為固定相，而以有機溶劑作為流動相。由于樣品中各物質分配系數不同，因而擴散速度不同，從而達到分離的目的。
試樣經層析后可用比移值（Rf）表示各組成成分的位置（比移值=原點中心至色譜斑點中心的距離與原點中心至流動相前沿的距離之比），由于影響比移值的因素較多，因此一般采用在相同實驗條件下對照物質對比以確定其異同。作為單體鑒別時，試樣所顯主色譜斑點的顏色（或熒光）與供置，應與對照（標準）樣所顯主色的譜斑點或供試品-對照品（1∶1）混合所顯的主色譜斑點相同。作為質量指標（純度）檢查時，可取一定量的試樣，經展開后，按各單體的規定，檢視其所顯雜質色譜斑點的個數或呈色（或熒光）的強度。作為含量測定時，可將色譜斑點剪下洗脫后，再用適宜的方法測定，也可用色譜掃描儀測定。