1、紙片擴散法藥敏試驗— 待測菌株接種物制備
（1）通用情況：從過夜孵育的平板，優先選擇哥倫比亞血瓊脂平板上的菌落上挑取數個單個菌落，直接接種4.5%生理鹽水制成菌懸液，使用比濁儀調整懸液的濁度使其達到0.5麥氏單位，使菌懸液中含有相當于ATCC 25922大腸埃希菌（1-2）*1012CFU/mL濃度。
（2）特殊情況：嗜血桿菌屬（本程序中所指的嗜血桿菌僅包括流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌）：從過夜孵育的HTM平板，直接接種4.5%生理鹽水制成菌懸液，使用比濁儀調整懸液的濁度使其達到0.5麥氏單位，使菌懸液中含有相當于ATCC 25922大腸埃希菌（1-2）*1012CFU/mL濃度。
2、紙片擴散法藥敏試驗— 接種平板
（1）調整好懸液的濁度后，用無菌棉簽浸入懸液內，緊貼試管內壁在液體上方旋轉拭子數次，除去棉簽上多余的液體，但也應適度。
（2）用拭子劃線整個瓊脂表面，從平板頂部到底部，均勻涂布，重復兩次此過程（一共三次）每次旋轉平板約60度，確保每次接種菌液均勻分布，最后在瓊脂平板的邊緣涂抹一圈，防止有流動的菌懸液，并使菌液涂布于整塊平板的每個角落。
（3）涂布菌液完成的平板，可在室溫放置一會（3-5分鐘），以便在放置含有藥物的紙片前使瓊脂吸收表面多余的水分，但放置時間不應超過15分鐘。
3、紙片擴散法藥敏試驗— 放置測試藥敏紙片
根據測試菌的不同，按照預先設定的分組，將抗菌藥物紙片貼于已接種細菌的瓊脂表面，每個紙片必須壓下以確保與瓊脂表面完全接觸無論是單獨放置的紙片或有紙片分配設備紙片必須分布均勻，兩紙片之間圓心的距離不少于24mm，紙片邊緣距離瓊脂邊緣不少于15mm。我室使用的MH平板直徑為90mm，放置不超過5塊紙片。由于一些藥物幾乎是瞬間擴散的，因此，一旦紙片與瓊脂表面接觸就不能再移動位置，若位置不佳可在瓊脂的另一個位置重新放置一個紙片。
4、紙片擴散法藥敏試驗— 孵育
（1）通用情況：在放置好紙片后，15分鐘內，將MH瓊脂倒置于號孵箱（35℃）中，孵育16～18小時（除外下面列出的需要延長孵育時間的情況）。嗜血桿菌屬、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌和鏈球菌KB紙片法測試平板應放置于含有5% CO2的環境進行孵育。
（2）延長時間培養：①測試苯唑西林、頭孢西丁對葡萄球菌的敏感性時，孵育時間必須達到24h，才能滿足對結果判斷的要求。②測試萬古霉素對金黃色葡萄球菌及腸球菌屬的敏感性，孵育時間必須達到24小時。
5、紙片擴散法藥敏試驗— 抑菌環直徑測量
（1）通用情況：35℃，經過16～18小時的孵育后，將貼有紙片的MH平板置于黑色不反光的背景上，采用游標卡尺，來測量抑菌環的直徑（完全抑制區的直徑），可以從平板的背面，利用反射光，用肉眼觀測，讀取最接近的毫米數（讀取一個整數）。沒有肉眼可見的明顯的生長的部位即是抑菌環的邊緣。一般情況下，在抑菌環邊緣出現只能在放大鏡下觀察到的微小菌落，可以忽略不計。
MH平板上的抑菌環呈均勻的圓形，測試菌株在平板上呈現融合生長菌苔，若出現單個菌落稀疏生長的情況，則說明接種時調制的菌液濃度過稀，需要尋找可能的原因，并重新再一次進行測試。
（2）特殊情況：①苯唑西林對葡萄球菌的抑菌環：抬起平皿，對向光源，利用透射光觀察苯唑西林紙片周圍的抑菌環中是否有任何細微的菌落生長，若是出現任何可以辨別的生長，均應判定苯唑西林耐藥。②利奈唑胺對葡萄球菌的抑菌環：利用透射光，用游標卡尺讀取抑菌環的數值。③復方新諾明的抑菌環：MH平板中存在一定量葉酸抑制劑的拮抗劑，會導致測試菌輕微的生長，因此，在測量復方新諾明的抑菌環直徑時應當忽略細微的生長情況（約20%），而將明顯出現生長的地方作為抑菌環的邊界進行測量。