1、吸光度
取本品，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液溶解并定量稀釋制成每1mL中含1mg的溶液，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在306nm的波長處測定，吸光度不得大于0.33，另取本品，用上述氫氧化鈉溶液溶解并定量稀釋制成每1mL中含0.2mg的溶液，在274nm的波長處測定，吸光度不得小于0.50。
2、結晶性
取本品少許，依法檢查（通則0981），應符合規定。
3、酸堿度
取本品，加水制成每1mL中含5mg的溶液，依法測定（通則0631），pH值應為5.0～7.5。
4、有關物質
照高效液相色譜法（通則0512）測定，臨用新制。
pH6.5磷酸鹽緩沖液：取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液125mL，加水250mL，混勻，用氫氧化鈉試液調節pH值至6.5，再用水稀釋至500mL。
供試品溶液：取本品適量，精密稱定，加pH6.5磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋制成每1mL中約含青霉素V3.6mg的溶液。
對照溶液：精密量取供試品溶液1mL，置100mL量瓶中，用pH6.5磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻。
系統適用性溶液：取青霉素V鉀對照品和青霉素對照品各10mg，置10mL量瓶中，加pH6.5磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻。
色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以pH3.5磷酸鹽緩沖液（取0.5mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調節pH值至3.5）-甲醇-水（10:30:60）為流動相A，以pH3.5磷酸鹽緩沖液-甲醇-水（10:55:35）為流動相B，先以流動相A-流動相B（60:40）等度洗脫，待青霉素V峰洗脫完畢后立即按下表進行線性梯度洗脫，檢測波長為268nm，進樣體積20μL。
系統適用性要求：系統適用性溶液色譜圖中，青霉素V峰與青霉素峰之間的分離度應大于6.0。
測定法：精密量取供試品溶液和對照溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。
限度：供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，單個雜質峰面積不得大于對照溶液主峰面積的1.5倍（1.5%），各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的3倍（3.0%），小于對照溶液主峰面積0.05倍的峰忽略不計。
5、青霉素V聚合物
供試品溶液：取本品約0.4g，精密稱定，置10mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。
對照溶液：取青霉素V對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每1mL中約含0.2mg的溶液。
系統適用性溶液（1）：取藍色葡聚糖2000適量，加水溶解并稀釋制成每1mL中約含0.1mg的溶液。
系統適用性溶液（2）：稱取本品約0.4g，置10mL量瓶中，加0.04mg/mL藍色葡聚糖2000溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。
色譜條件：用葡聚糖疑膠G-10（40~120μm）為填充劑，玻璃柱內徑：1.0~1.4cm，柱長：30~40cm，以pH7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液[0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液（61:39）] 為流動相A，以水為流動相B，流速為每分鐘1.5mL，檢測波長為254nm，進樣體積100~200μL。
系統適用性要求：系統適用性溶液（1）分別在以流動相A與流動相B為流動相記錄的色譜圖中，按藍色葡聚糖2000峰計算，理論板數均不低于400，拖尾因子均應小于2.0，藍色葡聚糖2000的保留時間比值應在0.93~1.07之間。系統適用性溶液（2）在以流動相A為流動相記錄的色譜圖中，高聚體的峰高與單體和高聚體之間的谷高比應大于2.0。對照溶液色譜圖中主峰與供試品溶液色譜圖中聚合物峰，與相應色譜系統中藍色葡聚糖2000峰的保留時間的比值均應在0.93~1.07之間。以流動相B為流動相，精密量取對照溶液連續進樣5次，峰面積的相對標準偏差應不大于5.0%。
測定法：以流動相A為流動相，精密量取供試品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以流動相B為流動相，精密量取對照溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。
限度：按外標法以青霉素V峰面積計算，青霉素V聚合物的量不得過0.6%。
6、水分
取本品，照水分測定法（通則0832第一法1）測定，含水分不得過1.5%。