又稱高效液相層析(或色譜)。其分離分析原理和經典的液體層析基本相同，但它采用了特有的固定相液體，加上在高壓下工作，又與自動分析儀器相結合，成為一種高效的分析方法。廣泛用于藥物、殺蟲劑、高分子量芳香族化合物、增塑劑、抗生素、各種有機試劑以及核酸、核苷酸類物質的分離分析。
高壓液體層析特點是采用長 (50～100cm) 而細(柱徑2～3mm)的層析柱，柱內填充物的粒度較細(直徑10～15μm)，在高壓下操作，因而分析速度很快。一般可分為以下4類：
①液-液分配層析。利用溶質在流動相中分配系數的差別而達到分離的目的，是應用最多的方法之一；
②液-固吸附層析。利用溶質在固體吸附劑上吸附能力的差別，而達到分離目的；
③離子交換層析。通過溶質和擔體的離子交換作用，利用不同溶質離子交換能力的差別，而達到分離目的；
④凝膠滲透層析。按溶質分子量大小而分離，也即分子篩層析。
高壓液體層析中常用的擔體是聚苯乙烯凝膠、多孔性二氧化硅微球、多孔玻璃珠等，這些層析擔體對高分子化合物及表面活性劑的分離很有效。